5-氟尿嘧啶(5-FU)是目前临床上最常用的抗癌药物之一,在癌症的治疗中发挥着重要作用,但因其存在体内吸收不规则、生物半衰期短、选择性差以及毒副作用大等问题,严重影响它在临床上的应用。为了实现对癌细胞具有靶向、药物输送的可视化、提高5-FU的疗效降低毒副作用,本研究设计了新型的5-FU纳米粒,以制备的荧光产率高、生物相容性好的红色荧光碳点为载体,负载化疗药物5-FU,得到可视踪的肝癌靶向缓释5-FU纳米粒,并通过体内外成像研究并分析了该纳米粒在微观细胞水平的动力学行为以及抗肿瘤作用。本课题主要研究内容如下:1.首先采用水热法制备了氮和硼掺杂的表面功能化红色荧光碳点(R-CDs),以R-CDs为载体与化疗药物5-FU通过氢键成功负载,得到CDs/5-FU纳米粒,然后通过酰胺反应在R-CDs表面连接聚乙二醇(PEG)和靶向分子乳糖酸(LA)制备LPC/5-FU纳米粒。通过激光粒度仪、透射电子显微镜(TEM)、傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)、紫外分光光度计(UV)、X射线粉末衍射仪(XRD)、荧光分光光度计等仪器对其进行表征。结果表明:荧光光谱显示制备的R-CDs激发波长在540 nm处且具有激发依赖特性,光照时间、p H稳定性良好,计算得到掺杂的PD0325901分子式红色碳点量子产率高达23.8%;通过TEM和激光粒度仪制备的LPC/5-FU形貌呈球形或类球形,粒径均一且稳定性良好;红外光谱图、XRD和TGA图谱证明了LPC/5-FU的成功制备。2.通过高效液相色谱法建立了5-FU含量测定的方法,对该方法进行方法学研究,用于测定LPC/5-FU纳米粒的药物负载量和包封率。结果表明:该方法具有专属性高、精密度佳和重复性好的特点,保留时间约3 min,可用于快速检测5-FU。在25μg/m L-200μg/m L浓度范围内有良好的线性关系。制备出的载药纳米粒的包封率为76.4%,负载量为37.6%。3.对LHepatic metabolismPC/5-FU纳米粒进行体外释放研究和体外安全性评价实验,体外释放结果表明:游离药5-FU在4 h内已基本释放完全,释放量为95.7%;LPC/5-FU中5-FU释放量随释放介质p H值的降低而增加,在p H 5.5的PBS缓冲溶液中释放速度最快,释放量最高,达到了87.7%,说明所制备的载药纳米粒在酸性缓冲溶液中分子间作用力减弱,会使其更持续高效的释放药物,在一定程度上达到了缓释、延长药效的效果。通过溶血实验评价R-CDs和LPC/5-FU体外安全性,结果表明:R-CDs和LPC/5-FU具有良好的生物相容性,安全性良好。MTT实验结果表明:LPC/5-FU纳米粒对正常肝细胞(7702)的毒性远低于游离药5-FU,原因可能是LPC/5-FU纳米粒表面的LA分子需特异性识别去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)发挥作用,正常肝细胞表面受体较少,因此对7702细胞毒性较弱。游离5-FU和LPC/5-FU纳selleck NMR米粒对两种肝癌细胞(Hep G2、SUN-739)的抑制作用均呈浓度依赖性和时间依赖性:随着作用时间的延长,LPC/5-FU纳米粒中5-FU逐渐释放完全,LPC/5-FU纳米粒可以达到和游离5-FU相当的抑制作用。4.通过倒置荧光显微镜和活体成像仪对制备得到的红色碳点R-CDs和LPC/5-FU纳米粒进行体内外成像,荧光显微镜成功观察到R-CDs和LPC/5-FU纳米粒在Hep G2的细胞质中发出红色荧光,细胞呈时间依赖性摄取R-CDs和LPC/5-FU纳米粒。选用昆明雌性小鼠尾静脉注射LPC/5-FU纳米粒进行活体成像,可观察R-CDs和LPC/5-FU纳米粒在体内的分布,实验结果表明以R-CDs为载体制备的LPC/5-FU可实现药物示踪,为该纳米粒细胞动力学行为的研究提供指导。5.以肝癌细胞Hep G2为实验对象,首先建立测定细胞内5-FU含量的高效液相方法,其次对细胞摄取机制、细胞动力学行为进行研究。以不同时间、不同摄取抑制剂研究LPC/5-FU进入细胞途径。结果:细胞摄取LPC/5-FU呈能量依赖性且主要是由网格蛋白(clathrin)参与介导的细胞内吞。以高效液相色谱法测定细胞内5-FU含量并进行细胞动力学研究,按照药物动力学单室模型和统计矩计算,结果表明:与对照制剂5-FU、LC/5-FU相比,LPC/5-FU纳米粒的半衰期延长,在细胞内滞留时间更长,细胞动力学行为得到改善,这可能是LPC/5-FU毒副作用低、体外抗肿瘤效果好的原因。以昆明雌性小鼠建立荷瘤小鼠模型,对5-FU和LPC/5-FU纳米粒进行体内药效评价。结果:制备的纳米粒在体内有良好的抗肿瘤效果。综上所述,本研究成功制备了氮硼掺杂的红色荧光碳点R-CDs以及LPC/5-FU荧光纳米粒,经验证以R-CDs制备的荧光纳米粒是生物成像和药物递送的优异载体材料、可降低5-FU毒副作用、改善细胞动力学行为以及提高药物在体内外的抗肿瘤效果。