目的:塑料颗粒污染对生态环境和人类健康已构成严重威胁。塑料物质在环境中被分解为微米塑料和纳米塑料,并可通过饮食、呼吸、皮肤暴露进入人体。微/纳米塑料除可导致消化道毒性、神经毒性、肝毒性、发育毒性外,还会造成生殖毒性。研究发现,小鼠经口摄入聚苯乙烯颗粒会导致血睾屏障破坏、精子数量减少、精子畸形率升高且睾酮含量下降,然而其毒性机制尚不明确。本课题通过检测纳米聚苯乙烯(PS-NPs)体外暴露对TM3小鼠睾丸间质细胞线粒体和细胞膜的影响来探究纳米塑料诱导睾丸生殖毒性损伤的机制。方法:将TM3细胞培养24 h后暴露于不同浓度的PS-NPs(0,50,100,150μg/m L)继续处理24 h,CCK8测定细胞活性;倒置显微镜观察细胞密度和形态;氧化应激检测试剂盒检测TM3细胞活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的水平;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位变化;透射电子显微镜观察线粒体形态结构;PCR法检测线粒体DNA(mt DNA)拷贝数;Annexin V/PI双染法检测TM3细胞凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白BAX和BCL-2的表达水平;比色法检测凋亡相关蛋白酶caGeneric medicinespase-3的活性;Real-time PCR法检测类固醇合成相关基因St AR,P450scc和17β-HSD的表达;ELISA法检测睾酮水平;靶向代谢组学分析TM3细胞代谢物水平变化;比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率;全细胞膜片钳检测细胞膜电位改变。结果:(1)CCK8法检测结果显示:细胞获悉更多活力随着PS-NPs浓度的增加而下降(P<0.05);倒置荧光显微镜观察显示,PS-NPs降低了TM3细胞密度并引起细胞形态变化。(2)红色荧光标记的PS-NPs处理TM3细胞24 h后,细胞内荧光强度明显增加,且呈剂量依赖性(P<0.05),表明PS-NPs可被TM3细胞内化。(3)氧化应激测试结果表明,PS-NPs引起TM3细胞ROS生成增加,且呈剂量依赖性(P<0.05)。同时,中、高剂量PS-NPs暴露后,MDA生成显著增加,而细胞内抗氧化的SOD活性和GSH含量显著降低(P<0.05)。(4)Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术表明PS-NPs引起细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。100和150μg/m L PS-NPs暴露24 h后TM3细胞内抗凋亡蛋白BCL-2的表达下调,而促凋亡蛋白BAX表达明显增加(P<Compound C分子式0.05)。同时,PS-NPs处理显著升高了caspase-3活性。(5)透射电子显微镜观察结果表明PS-NPs处理组细胞出现线粒体肿胀,嵴结构消失;JC-1荧光探针发现PS-NPs导致TM3细胞线粒体膜电位下降,且呈剂量依赖性(P<0.05),表明PS-NPs能够扰乱TM3细胞线粒体功能。(6)靶向代谢组学显示,中剂量PS-NPs处理后有14种代谢物发生显著变化(P<0.05),其中丙酮酸上调,而5'-三磷酸腺苷、环磷酸腺苷、焦磷酸硫胺素、二磷酸腺苷、5'-二磷酸鸟苷、乳酸、琥珀酸、磷酸二羟基丙酮、β-D-果糖6-磷酸、柠檬酸、D-果糖1,6-二磷酸、异柠檬酸和顺乌头酸均下调,表明PS-NPs会影响TM3细胞能量代谢。(7)Real-time PCR检测结果发现PS-NPs降低了TM3细胞类固醇合成相关基因St AR,P450scc和17β-HSD的表达。同时,中、高剂量处理组睾酮水平显著下降(P<0.05),表明PS-NPs能够影响TM3细胞睾酮的合成。(8)在100、150μg/m L PS-NPs处理组,LDH漏出率显著增加(P<0.05)。此外,全细胞膜片钳结果显示,中、高剂量的PS-NPs暴露导致了细胞膜去极化(P<0.05),表明PS-NPs能够引起TM3细胞膜损伤。结论:(1)PS-NPs可被TM3细胞内化,并降低细胞活性;(2)PS-NPs可诱导TM3细胞氧化应激,引起线粒体损伤和细胞凋亡;(3)PS-NPs可导致TM3细胞能量代谢异常和类固醇合成障碍;(4)PS-NPs可破坏TM3细胞膜完整性。