研究背景与研究目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,在女性所有恶性肿瘤中其发病率位居第1位,死亡率为第2位。化疗是常用的乳腺癌治疗方法之一,化疗的临床应用显著提高了乳腺癌患者的生存率,但化疗后复发和转移是导致乳腺癌患者不良预后的重要原因。乳腺癌化疗后复发和转移的机制复杂,至今尚不明确。探明乳腺癌化疗后复发转移的相关机制对于研发对应靶向药物,提高乳腺癌患者生存率具有重要意义。细胞重生(anastasis)是近年来发现的细胞由于凋亡压力的刺激而激活了效应caspase后继续存活的现象。诱导细胞发生凋亡是肿瘤化疗的重要策略,而细胞逃逸凋亡可能是导致化疗后肿瘤复发和转移的重要原因。近年来有研究显示肿瘤细胞在受到凋亡刺激(如化疗药物处理)后部分细胞会发生细胞重生,而且重生的肿瘤细胞表现出更强的迁移能力和耐药性。但关于细胞重生在乳腺癌化疗后复发和转移中的作用及其机制目前尚不清楚。因此,本研究的目的是分析细胞重生在乳腺癌化疗后复发和转移中的作用及其分子机制。研究方法与结果第一部分细胞重生对乳腺癌恶性行为的影响1.乳腺癌细胞经化疗药物处理后可发生细胞重生:本研究采用实验室前期构建的效应caspase活性示踪系统m~(Cas)Express监控细胞重生的发生。该示踪系统能使激活效应caspase后存活的哺乳动物细胞及其子代细胞表达绿色荧光蛋白ZsGreen。为分析乳腺癌细胞在化疗药物处理后是否发生细胞重生,我们首先选择两种乳腺癌细胞系构建了稳定表达m~(Cas)Express示踪体系的乳腺癌细胞系BT474~(Cas)和MDA-MB-231~(Cas)。利用两种常用的化疗药物(阿霉素或顺铂)处理BT474~(Cas)和MDA-MB-231~(Cas),通过荧光显微镜观察、流式细胞术检测及活细胞实时成像等方法,发现两种药物处理以上此网站两种乳腺癌细胞系后,部分细胞在效应caspase激活后可以继续存活并增殖,说明化疗药物处理后的乳腺癌细胞可以发生细胞重生。2.化疗后复发的乳腺癌组织中重生细胞比例升高:为了确定细胞重生是否参与乳腺癌化疗后的复发,我们用MDA-MB-231~(Cas)细胞对裸鼠进行原位荷瘤。在肿瘤生长到50 mm3时随机分组进行阿霉素(7.5mg/kg)治疗和溶剂治疗(对照组)。治疗4周后,治疗组小鼠肿瘤减小至触摸不到,此时停止治疗,观察肿瘤复发情况。通过流式细胞术检测对照组和治疗后复发肿瘤中的ZsGreen~+细胞比例,发现两组肿瘤中都能检测到一定比例的ZsGreen~+细胞,但阿霉素治疗复发后的小鼠肿瘤中ZsGreen~+细胞比例显著高于对照组小鼠肿瘤。3.细胞重生对乳腺癌细胞恶性行为的影响为了研究重生后的乳腺癌细胞的表型,我们首先采用流式细胞分选技术从经药物处理后恢复的细胞中分选出ZsGreen~+细胞(重生细胞)和ZsGreen~-细胞(未激活效应caspase细胞);同时从仅用DOX处理的细胞中分选出ZsGreen~-细胞作为对照细胞。对来自两种药物处理的两种肿瘤细胞系的ZsGreen~-细胞和ZsGreen~+细胞以及相应的对照细胞进行表型分析,取得了以下结果:1)重生后的乳腺癌细胞具有更强的增殖能力:EdU掺入实验和克隆形成实验结果显示,与对照和ZsGreen~-细胞相比,ZsGreen~+细胞增殖能力显著增强。2)重生后的乳腺癌细胞具有更强的迁移和侵袭能力:利用Transwell实验,我们检测了 ZsGreen~+、ZsGreen~-和对照细胞的迁移和侵袭能力,发现ZsGreen~+细胞的迁移和侵袭能力均显著强于ZsGreen~-和对照细胞。3)重生后的乳腺癌细胞具有更强的体内成瘤能力:裸鼠原位荷瘤实验结果显示重生细胞所形成的肿瘤生长更快、肿瘤中Ki-67阳性细胞明显多于对照细胞和ZsGreen~-细胞形成的肿瘤。4)重生的乳腺癌细胞具有更强的体内转移能力:为了检测细胞重生对肿瘤转移的影响,我们将对照、ZsGreen~-和ZsGreen~+分别通过尾静脉注射建立肺转移模型,发现注射重生细胞的小鼠的肺转移灶较注射对照和ZsGreen~-细胞的小鼠均显著增多,表明重生细胞具有更强的体内转移能力。4.重生的乳腺癌细胞高表达CDH12基因:为了分析细胞重生改变乳腺癌细胞恶性行为的机制,我们从ADR处理后的BT474和MDA-MB-231细胞中分选获得ADR-ZsGreen~-和ADR-ZsGreen~+细胞并进行了转录组测序。利用RT-qPCR对测序获得的在两组ADR-ZsGreen~+细胞中都上调超过4倍的基因在来自两种药物处理的两种乳腺癌细胞的对照、ZsGreen~-和ZsGreen~+细胞中进行了验证,发现只有GDLGX818抑制剂AP1L1和CDH12两个基因在四组重生细胞中均显著上调,相关研究显示CDH12与肿瘤恶性行为相关。第二部分CDH12通过ERK/CREB调控重生乳腺癌细胞的恶性行为1.重生的乳腺癌细胞通过上调CDH12表达增强增殖和迁移能力1)重生的乳腺癌细胞增殖和迁移能力的增强依赖于CDH12上调:为了确定重生的乳腺癌细胞增殖和迁移能力的改变是否是由于CDH12表达上调所致,我们在对照、ZsGreen~-和ZsGreen~+细胞中敲低CDH12基因。EdU掺入实验、克隆形成实验和transwell实验显示,敲低CDH12显著抑制了三类细胞的增殖和迁移并减小了它们之间增殖和迁移能力的差异。为进一步证实CDH12在乳腺癌细胞的增殖和迁移中的作用,我们在BT474细胞和MDA-MB-231细胞中过表达CDH12基因,发现过表达CDH12基因促进乳腺癌细胞增殖和迁移。2)敲低CDH12抑制重生细胞体内成瘤和转移:为了进一步明确CDH12在重生细胞表型改变中的作用,我们又进行了裸鼠荷瘤实验和肺转移实验,发现敲低CDH12抑制重生细胞形成的移植瘤生长和重生细胞的肺转移。3)CDH12表达上调与乳腺癌患者不良预后相关:对公共数据库资源分析显示,乳腺癌患者CDH12表达水平与患者肿瘤分期、大小以及不良预后相关。2.CDH12促进乳腺癌细胞增殖和转移的机制1)CDH12通过激活CREB促进细胞增殖和迁移:我们通过Western blotting发现重生细胞内CREB的磷酸化增强,而敲低CDH12可以显著抑制CREB磷酸化。抑制CREB活性或敲低CREB表达均可以有效抑制重生细胞增殖和迁移能力的增强。在BT474和MDA-MB-231细胞中过表达CDH12可以增加CREB的磷酸化,抑制CREB活性也可以阻止过表达CDH12引起的细胞增殖和迁移能力增强。2)CDH12通过ERK通路调控CREB活性:为了确定CDH12激活CREB的分子机制,我们对CREB上游的激酶PKA、PKC和ERK进行了分析,发现只有ERK的磷酸化在四组ZsGreen~+细胞均显著增高,并且敲低CDH12降低ERK磷酸化。抑制ERK活性或敲低ERK表达可以拯救重生细胞中由于CDH12上调而引起的CREB磷酸化的增加以及细胞增殖和迁移能力的增强。同时,过表达CDH12显著增加BT474和MDA-MB-231细胞中ERK的磷酸化,抑制ERK活性可以抑制过表达CDH12引起的CREB磷酸化的上调以及细胞增殖和迁移能力的增强。3.细胞重生引起CDH12启动子区域DNA甲基化和抑制性组蛋白修饰降低。为分析CDH12在重生细胞中表达上调的机制,我们对ZsGreen~+、ZsGreen~-和对照细胞的CDH12启动子区域的DNA甲基化水平进行了检测,发现重生细胞CDH12启动子区域DNA甲基化水平降低;ChIP检测组蛋白修饰发现抑制性组蛋白修饰H3K9me3、H3K27me3和H2AK119ub1在重生细胞的CDH12启动子区域的富集显著降低,而激活性标志H3K4me3在该区域的富集水平显著升高。提示重生后乳腺癌细胞CDH12表达的上调可能是由于表观调控改变。研究结论本文利用两种常用的乳腺癌细胞系和两种临床常用化疗药物,研究细胞重生在乳腺癌化疗后复发转移中的作用,得出以下结论:1.化疗药物处理后的乳腺癌细胞可以在激活效应caspase后重生,化疗后的乳familial genetic screening腺癌复发有重生细胞的参与;2.重生的乳腺癌细胞增殖、体外迁移以及体内的生长和转移能力增强;3.重生的乳腺癌细胞增殖和迁移能力的增强依赖于CDH12的上调,上调的CDH12通过激活ERK/CREB促进细胞的增殖和迁移;4.重生细胞CDH12启动子区域DNA甲基化水平以及抑制性组蛋白修饰降低。