研究背景淋球菌耐药性已成为全球范围的公共卫生问题,为应对不断严峻的耐药形势,既要加强对淋球菌抗生素耐药性的持续监测,也要解决耐药菌快速检测和淋病替代治疗方案这两大需求。开发耐药性快速检测方法有利于耐药菌的及时发现,可补足传统方法在一线临床用药指导中检测时间较长的缺陷。对目前临床已批准的抗生素及新开发的抗菌药物进行筛选,可确保在一线药物治疗失败时仍能获得替代治疗。本研究从以下三个部分开展,以期在加强淋球菌抗生素耐药监测、耐药菌感染的快速检测和淋病的替代治疗等方面提供建议。第一部分 传统药物敏感性检测方法的试剂评估与一致性比较第一节 琼脂稀释法中替代生长补充剂对药敏结果的影响[目的]评估在琼脂稀释法中使用替代生长补充剂对药敏结果的影响。[方法]以添加Vitox增菌剂为对照组,评估添加无菌脱纤维绵羊血或牛血红蛋白作为含抗生素培养基中的生长补充剂在检测青霉素、庆大霉素、四环素、大观霉素、阿奇霉素、环丙沙星、头孢曲松和唑利氟达星等8种抗生素药物敏感性上的一致性。[结果]羊血组8种抗生素药敏检测结果的基本一致率和分类一致率均在90.00%以上,小误差率均低于7.00%。牛血红蛋白组对唑利氟达星、青霉素和头孢曲松的药敏检测结果的一致性较低。[结论]无菌脱纤维绵羊血作为替代生长补充剂具有与Vitox增菌剂良好的一致性,较Vitox增菌剂成本更低且更易获得。第二节 纸片扩散法与琼脂稀释法的一致性比较[目的]评估纸片扩散法在淋球菌药物敏感性检测试验中的准确性。[方法]分别使用琼脂稀释法与纸片扩散法进行头孢曲松、头孢克肟和大观霉素的药物敏感性测定,计算两种方法的一致性。[结果Canagliflozin核磁]与琼脂稀释法相比,纸片扩散法测得大观霉素、头孢曲松和头孢克肟药敏结果的分类一致率分别为87.64%、83.45%和80.31%。配对卡方检验结果表明两种方法分类结果存在显著性差异。[结论]纸片扩散法检测大观霉素、头孢曲松和头孢克肟药物敏感性结果的准确性较低,可能不是我国临床实践中淋球菌耐药监测的合适选择。第二部分 淋球菌阿奇霉素耐药性的快速分子检测方法研究第一节 23S rRNA C2611T突变诊断阿奇霉素耐药性准确性的Meta分析[目的]评估severe alcoholic hepatitis23S rRNA C2611T突变诊断淋球菌阿奇霉素耐药性的准确性。[方法]检索多个数据库,使用Meta分析的方法汇总分析23S rRNA C2611T突变诊断淋球菌阿奇霉素耐药性的灵敏度和特异度。[结果]共纳入20篇文献,23S rRNA C2611T诊断淋球菌阿奇霉素最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)为 4-128 mg/L 的灵敏度为 91.9%,特异度为 95.9%。[结论]23S rRNA C2611T突变对诊断淋球菌阿奇霉素MIC在4-128mg/L具有较高的准确性。第二节 MAMA-PCR快速检测淋球菌阿奇霉素耐药突变方法的建立[目的]建立基于错配扩增突变分析的SYBRGreen快速实时PCR方法(mismatch amplification mutation assay-polymerase chain reaction,MAMA-PCR),以检测淋球菌临床分离株中的23S rRNAA2059G和C2611T突变。[方法]根据23S rRNAA2059G和C2611T突变设计错配引物进行qPCR反应,并加入SYBR Green I荧光染料检测双链DNA。将待测基因与内参Pexidartinib molecular weight基因的Ct值对比,选择合适的△Ct值鉴定突变型和野生型菌株。[结果]A2059G突变基因△CT值选取3,C2611T突变基因△Ct选取为3,△Ct≤3时被鉴定为突变型,该方法检测限为100拷贝/μl。[结论]MAMA-PCR法是一种可用于检测阿奇霉素耐药突变的快速分子检测方法。第三节MAMA-PCR快速检测淋球菌阿奇霉素耐药性的应用[目的]评估MAMA-PCR法分子诊断淋球菌临床分离株阿奇霉素耐药性的灵敏度和特异度。[方法]使用MAMA-PCR法对全国多地区收集的367株淋球菌临床分离株进行23S rRNA突变检测并诊断其阿奇霉素耐药性,与琼脂稀释法检测的MIC进行对比,以评估此方法的准确性。[结果]367株临床分离株中共计5株C2611T突变株,4株A2059G突变株。MAMA-PCR法通过检测C2611T突变诊断阿奇霉素MIC为4-128mg/L的灵敏度为100%,特异度为99.72%;检测A2059G突变诊断阿奇霉素MIC≥256mg/L的灵敏度和特异度均为100%。[结论]MAMA-PCR法在诊断淋球菌阿奇霉素MIC>2mg/L具有较高的准确性。第三部分淋球菌感染替代治疗药物的体外效应评估第一节庆大霉素及其联合疗法的抗淋球菌体外效应评估[目的]评估庆大霉素及其联合疗法对我国淋球菌临床分离株的体外效应。[方法]使用琼脂稀释法对全国多地区收集的380株淋球菌临床分离株进行庆大霉素、头孢曲松和阿奇霉素的药物敏感性检测,通过琼脂稀释棋盘法检测庆大霉素+头孢曲松和庆大霉素+阿奇霉素药物组合的相互作用。[结果]36.60%的分离株对庆大霉素表现出完全敏感,61.30%表现为中度敏感。庆大霉素+阿奇霉素和庆大霉素+头孢曲松联合用药总体表现为无关作用。在阿奇霉素耐药菌株中,阿奇霉素单独用药的MIC几何平均数为2.532,联合用药时为0.397,较单独用药MIC降低84.3%。[结论]我国淋球菌菌株对庆大霉素较为敏感,与其他药物联合用药时可显著降低MIC,可能作为未来我国淋病治疗的替代方案。第二节新型四环素类抗生素的抗淋球菌体外效应评估[目的]评估我国淋球菌临床分离株对第三代四环素类抗生素的药物敏感性及MIC间的相关性。[方法]使用琼脂稀释法检测全国多地区收集的412株淋球菌对头孢曲松、阿奇霉素、四环素、米诺环素、替加环素、依拉环素和奥马环素的药物敏感性,通过相关系数评估3种第三代四环素类药物与头孢曲松、阿奇霉素和四环素MIC之间的相关性。[结果]经检测,412株淋球菌临床分离株对头孢曲松MIC90为0.25mg/L,阿奇霉素为1mg/L,四环素为64mg/L,米诺环素为64mg/L,替加环素为0.5mg/L,依拉环素为0.5mg/L,奥马环素为4mg/L。奥马环素和依拉环素的MIC与四环素呈弱相关性,替加环素MIC与阿奇霉素呈弱相关性,米诺环素MIC与四环素呈强相关性。[结论]对比3种第三代四环素类药物的体外效应和可行性,替加环素具有较好的体外抗淋球菌效应,可能作为我国淋病治疗的替代方案。