研究背景与目的先天性巨结肠(Hirschsprung’s disease,HSCR)是一种常见的小儿肠道发育畸形,临床表现为出生后胎便排出延迟、顽固性便秘和腹胀,且常伴有小肠结肠炎和低位肠梗阻。目前对于先天性巨结肠的治疗主要以手术为主,尽管手术方式不断改进,但术后并发症如大便失禁或便秘等仍难以避免,给患儿的生活及健康带来了较大影响。研究认为先天性巨结肠是一种由遗传因素和环境因素共同作用引起的复杂性疾病,主要发病机制与肠神经嵴细胞(Enteric neural crest cells,ENCCs)的异常迁移、存活和分化有关。研究还发现ENCCs的正常发育不仅受特定时间点内特Taurine IC50定基因的表达调控,肠壁内局部微环境也起到重要的作用。肠道肌层巨噬细胞(muscularis macrophages,MMs)主要存在于肠壁环形肌和纵行肌之间,是肠道微环境的重要组成成分。MMs在胃肠动力调节方面及肠神经元保护中发挥重要作用,并且胚胎期MMs在肠道中的定植时间早于肠神经干细胞的发育和功能性肌间神经丛的形成时间。因此,本研究拟探索MMs在HSCR患儿结肠肠壁中的表型及分布,并在体外构建巨噬细胞与神经干细胞共培养体系,探究MMs调控神经干细胞生物学行为的作用及机制。方法1、通过免疫组化及免疫荧光染色检测正常小鼠胎鼠肠道和HSCR患儿无神经节细胞的狭窄段结肠及有神经节细胞的扩张段结肠中的MMs的分布与表型。在体外将THP-1单核细胞极化为M1或M2型巨噬细胞,并与神经干细胞(SH-SY5Y、SK-N-BE2)进行分层共培养,通过Transwell细胞迁移实验、EdU细胞增殖实验和流式细胞术检测M2型巨噬细胞对共培养神经干细胞的迁移、增殖和凋亡特性进行检测。2、Protein Tyrosine Kinase抑制剂通过荧光定量PCR验证miRNA-93-5p在M1型和M2型巨噬细胞中的差异表达,同时在M2型巨噬细胞中转染miRNA-93-5p模拟物或抑制物,并与神经干细胞进行共培养,将共培养的细胞分为三组:M2+miRNA-93-5pmimics;M2+miRNA-93-5pinhibitor;M2+miRNA-93-5p NC;并通过Transwell细胞迁移实验、EdU细胞增殖实验和流式细胞术对共培养的神经干细胞迁移、增殖和凋亡特性进行检测。3、通过双荧光素酶报告实验验证miRNA-93-5p对AHNAK基因的靶向调控作用。用实时荧光定量PCR及Western blotting检测HSCR患儿无神经节细胞的狭窄段结肠及有神经节细胞的扩张段结肠中miRNA-93-5p和AHNAK的表达水平,并检测M2型巨噬细胞来源的miRNA-93-5p对共培养的神经干细胞中AHNAK表达水平的影响。结果1、正常小鼠胎鼠肠道免疫荧光染色结果显示MMs主要呈Arg-1、CD163阳性,与M2型巨噬细胞表型相似,主要分布于肠神经节细胞周围。在HSCR患儿结肠标本中,有神经节细胞的扩张段结肠中肌层巨噬细胞的表型及分布特点与小鼠胎鼠肠道一致,但在无神经节细胞的狭窄段结肠中MMs的数量显著减少。在体外成功诱导了 M2型巨噬细胞并与神经干细胞共培养,结果显示M2型巨噬细胞可促进神经干细胞的增殖和迁移,并抑制其凋亡。2、M2型巨噬细胞中的miRNA-93-5p表达水平较M1型巨噬细胞明显增高。在共培养细胞模型中,与 M2+miRNA-93-5p mimics 和 M2+miRNA-93-5p NC 两组相比,在 M2型巨噬细胞中下调miRNA-93-5p的表达可以显著抑制神经干细胞的迁移和增殖并促进其凋亡。3、双荧光素酶报告实验结果显示miRNA-93-5p可靶向调控AHNAK。在HSCR患儿无神经节细胞的狭窄段结肠中miRNA-93-5p的表达水平明显降低,而AHNAK的表达水平增高。且M2型巨噬细胞来源的miRNA-93-5p可以负向调控共培养的神经干细胞中AHNAK的表达。结论1、正常小鼠胎鼠肠道及HSCR有神经节细胞的扩张段结肠中肌层巨噬细胞主要以M2型巨噬细胞表型为主,而HSCR无神经节细胞的狭窄段结肠中M2表型的肌层巨Medicine quality噬细胞显著减少。2、M2型巨噬细胞在体外通过miRNA-93-5p/AHNAK促进神经干细胞的增殖和迁移,并抑制其凋亡,进而推测肌层巨噬细胞可能通过调控肠神经干细胞而参与HSCR的发病。