硫代亚磺酸酯类化合物具有抑菌、降血脂、降血压、抗癌、抗氧化等功效,广泛应用于农业、医药业以及养殖业等行业。目前该类化合物的生产主要通过化学合成或植物提取获得。植物提取过程复杂,受热会分解成二烯丙基硫醚类化合物,使其药用效果大大降selleck抑制剂低。化学合成则存在产率低和污染严重等问题,极大限制了其在不同行业的大规模应用。酶法催化合成硫代亚磺酸酯类化合物的生产工艺具有绿色高效等优点,具有广泛的应用价值,其中大蒜素相关应用研究最为广泛。催化生成大蒜素等硫代亚磺酸酯类化合物的蒜氨酸酶主要存在于大蒜等百合科植物的液泡当中,酶的产量有限且提取工艺复杂。利用微生物异源表达蛋白已经成为获取酶最简单快速的方法,但表达植物源蒜氨酸酶存在包涵体多表达困难等技术难题。因此,微生物来源的同工酶具有易于实现异源表达和规模化生产的优势,在酶法合成硫代亚磺酸酯类化合物中具有巨大的优势和开发潜力。本实验室前期从菌株Klebsiella sp.C2和Pseudomonas sp.C1中筛选获得了两种植物源蒜氨酸酶的细菌源同工酶胱硫醚裂解酶(KP和PP),具有高效催化合成系列硫代亚磺酸酯类化合物的活性。为系统解析新型蒜氨酸酶的催化性质,本研Secondary autoimmune disorders究在大肠杆菌中实现了酶的高表达并围绕其酶学性质展开研究,在此基础上对酶的热稳定性进行改造以及在生物安全菌株Saccharomyces cerevisiae中进行表达及发酵优化,主要取得了以下成果:一、将产酶菌株 Klebsiella sp.C2 和 sp.C1 中的酶 KP 及 PP在E.coli C43(DE3)中高效表达。将酶KP和PP在E.coli BL21(DE3)及E.coli C43(DE3)中表达,确定了酶的最佳诱导温度为16℃。通过对比酶在两个宿主中的表达情况,发现酶在E.coli C43(DE3)中表达效果要优于 E.coli BL21(DE3),E.coli C43(DE3)-pET24a(+)-kp/pp的表达均没有包涵体的产生,每升菌液可产酶活为26631.13±254.24 U及21588.46±232.12 U,分别为E.coli BL21(DE3)中表达量的 2.98 和 3.42 倍。二、测定了大肠杆菌E.coli C43(DE3)表达的KP和PP的酶学性质。对E.coli C43(DE3)表达的KP、PP的酶学性质进行测定,以L-(±)-蒜氨酸为底物,发现KP的最适反应温度为35℃,在0～35℃较为稳定,最适反应pH为9.0,在pH值为8.0～10.0较为稳定,对L-(±)-蒜氨酸的Km值为18.71±0.26 mM,Ks值为118.84±0.59/s,对S-甲基-L-半胱氨酸亚砜的Km值为35.95±0.28 mM,Ks值为106.21±0.34/s。PP的最适反应温度为55℃,在0～45℃较为稳定,最适反应pH为7.0,在pH值为7.0～9.0较为稳定,对L-(±)-蒜氨酸的Km值为7.82±0.14 mM,Ks值为55.80±0.28/s,对S-甲基-L-半胧氨酸亚砜的Km值为7.33 ±0.07 mM,Ks 值为63.48± 0.1 6/s。金属离子Ca2+及Mg2+对KP、PP具有明显的促进作用,Cu2+及selleckchem MG132SDS对KP、PP有显著抑制作用。对热稳定性较好的PP进行酶干粉喷雾干燥,计算酶活的回收率并评估酶干粉的稳定性。经过喷雾干燥后PP的质量回收率为57.80%,酶活回收率为52.28%,在4℃下长期保存,酶活几乎没有损失;在37℃下放置4个月酶干粉保留77.21%的酶活。三、较高催化活性的KP在酿酒酵母CEN.PK102-5B中实现异源表达,通过发酵培养基优化提高了 KP在酿酒酵母中的表达量。将PJFE3-P-K-Δ1Δ2-kp重组质粒在酿酒酵母CEN.PK102-5B中表达,以SD培养基作为初始培养基,经过单因子优化、Plackett-Burman实验设计以及中心复合响应面设计优化培养基,最终确定优化培养基配方为:糖蜜30.8 g/L,玉米浆干粉25.4g/L,酵母粉16.4 g/L,葡萄糖10.0g/L,磷酸二氢钾10.0g/L。与SD培养基相比,发酵罐酶活提高了 22.93%。四、较高热稳定性的PP进行易错PCR并进行高通量筛选,获得两个耐热性进一步提高的突变酶4-35-tbPP和6-41-tbPP。针对PP酶的热稳定性提高对其进行易错PCR突变,经过高通量筛选出4-35-tbPP、6-41-tbPP两个热稳定性提高的突变蛋白。其中4-35-tbPP最适反应温度为60℃,在0～55℃比较稳定,6-41-tbPP的最适反应温度为55℃,在0～65℃时较为稳定,热稳定性明显高于野生酶PP。4-35/6-41-tbPP的最适反应pH值为7.0,4-35-tbPP在pH值6.0～9.0 时较为稳定,6-41-tbPP在pH值7.0～9.0时较为稳定。4-35/6-41-tbPP 对 L-(±)-蒜氨酸的Km值分别为 8.48±0.39 mM、8.54 ±0.11 mM,Ks值为57.73±0.69/s、59.02±0.22/s,与 PP 相差不大。4-35/6-41-tbPP 在55℃的半衰期为40 h和43 h,分别是PP半衰期的1.60和1.72倍。测序发现4-35-tbPP的第389位氨基酸由赖氨酸突变为精氨酸;6-41-tbPP的第254位氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸,第284位氨基酸由谷氨酸突变为缬氨酸,氨基酸的改变增加突变酶的热稳定性。进一步对6-41-tbPP的突变氨基酸进行单点突变,发现第254氨基酸对酶的热稳定性提升有关键作用。