梨属蔷薇科,是我国三大果树之一。在梨生产过程中,由于花粉管无法在花柱组织中快速健康生长并到达胚珠,导致受精失败,结实率被大大降低,严重影响果实产量。胼胝质广泛分布于花粉管细胞壁中,为花粉管侧壁提供足够的机械强度来抵抗膨压,同时也会形成胼胝质塞以维持花粉管快速伸长,并及时释放精细胞完成双受精。然而,我们对该过程中胼胝质调控花粉管生命周期的分子机制知之甚少。因此解析胼胝质合成在梨花粉管整个生命周期中的精细调控机制,为最终克服低坐果率以及高产梨品种选育具有重要的意义。本研究以‘砀山酥梨’(Dangshansuli)为花粉材料进行体外培养;以‘翠冠梨’(Cuiguanli)为母本,‘砀山酥梨’(Dangshansuli)为父本进行体内授粉试验,对授粉受精过程中胼胝质代谢调控梨花粉管生命周期的功能开展研究。主要结果如下:1.持续的胼胝质塞沉积维持梨花粉管生命周期。本研究发现在体外培养条件下,梨花粉管从培养3小时后(hours post-culture,HPC)开始快速增长,随后在15 HPC下降;同时在细胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD)启动下,处于生长后期阶段的花粉管逐渐加速衰老,其花粉管半生命周期(semi-growth duration,GD_(50))为16.16小时;整体呈现S型生长-衰老曲线。此外,在整个花粉管生命周期中伴随着胼胝质塞持续沉积,多达四个以上,且相对胼胝质含量的变化与花粉管伸长率具有高度相关性(R=0.991)。本研究还发现在体外培养条件下,通过外源施加胼胝质合成抑制剂2DDG(2-deoxy-D-glucose)处理梨花粉,显著降低了梨花粉管中胼胝质塞的数量和相对胼胝质含量;同时显著抑制了梨花粉管的生长并缩短GD_(50);此外,在体内授粉试验中,通过0.5 m M 2DDG处理梨花粉,其花柱组织内胼胝质塞的实际密度被显著降低,并且花粉管长度仅生长到柱头长AY-22989小鼠度的53.6%,最终无法完成受精。这些结果表明,持续不断的胼胝质塞沉积是维持梨花粉管生命周期的必要基础,当其合成受阻会导致梨花粉管早衰从而丧失育性。2.PbrCalS1B.1是调控花粉管胼胝质合成的关键基因。本研究系统地鉴定了九种蔷薇科植物(苹果、西洋梨、白梨、桃、欧洲甜樱桃、梅、月季、黑树莓、森林草莓)的基因组,共鉴定出100条CalS基因,通过构建系统发育树,将蔷薇科物种的CalS成员分为3个亚组,9个小簇,这些小簇与拟南芥CalS基因高度同源,且没有进化出额外的小簇。利用转录组数据、GUS(β-glucuronidase)组织定位及RT-q PCR(Real-Time quantitative Polymerase Chain Reaction)分析表明,PbrCalS1B.1在梨花粉管中特异性表达;最终通过亚细胞定位分析发现PbrCalSLGX8181B.1是一种定位于质膜的蛋白。本研究还通过构建atcals5-1/PbrCalS1B.1过表达转基因株系来恢复atcals5-1突变体的育性功能,发现其角果长度、种子数量、种子缺失率、花粉粒细胞壁形态、胼胝质塞数量几乎恢复到野生型水平。此外,本研究利用一种反义寡聚核苷酸(Antisense Oligonucleotide,as-ODN)技术抑制梨花粉管生长过程的PbrCalS1B.1的表达水平,发现梨花粉管中胼胝质塞的数量和相对胼胝质含量急剧下降;同时加速了梨花粉管PCD进程,导致GD_(5optical pathology0)显著降低;其梨花粉活力也被大大降低。这些结果表明PbrCalS1B.1是调控花粉管胼胝质合成并介导花粉管育性功能的关键基因。3.PbrbZIP52转录调控PbrCalS1B.1促进胼胝质塞沉积维持梨花粉管生命周期。转录分析发现在梨花粉管生长过程中存在一个bZIP成员PbrbZIP52,其表达量与PbrCalS1B.1表达量密切相关(R=0.975),且二者具有相似的组织表达模式;通过抑制梨花粉管生命周期内PbrbZIP52的表达水平,发现PbrCalS1B.1的表达量显著下调;此外,在梨花粉管中特异性沉默PbrbZIP52导致胼胝质塞数量减少,相对胼胝质含量显著降低,导致梨花粉管生长受限,甚至加速其早衰死亡;与特异性沉默PbrCalS1B.1处理相似。此外,本研究发现PbrCalS1B.1启动子序列存在两个A-box元件;通过酵母单杂(Yeast one hybrid,Y1H)、电泳迁移率转移分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)和瞬时转化活性分析表明PbrbZIP52与PbrCalS1B.1的启动子具有相互作用。为了进一步验证这种互作关系,本研究对PbrCalS1B.1启动子中A-box元件进行定点突变;结果发现,单个A-box突变大大削弱了PbrbZIP52与PbrCalS1B.1启动子的结合强度,且两个A-box同时突变导致二者的结合几乎完全被抑制。这些结果证实了PbrbZIP52与PbrCalS1B.1的启动子相互结合的特异性。以上结果揭示了一个全新的胼胝质调控梨花粉管生命周期影响其育性的调控机制:转录因子PbrbZIP52通过与PbrCalS1B.1启动子中的A-box元件结合来调控其转录,以促进胼胝质塞沉积维持正常的梨花粉管生命周期,最终完成双受精。这一发现为培育高产梨品种和稳定商业果园的结实率提供理论指导。