花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)是芸香科(Rutaceae)花椒属植物,其果皮具有香味和麻味,是烹饪中的重要调味品。花椒果皮也是一种传统中药,具有抗炎镇痛的医疗效果和抗衰老、抗癌的保健价值。近年来,花椒全国栽植面积达2500万亩,特别在北方干旱少雨的地区广泛栽植。虽然花椒植株抗旱性较强,但品种之间抗旱能力具有明显差异。开展花椒响应干旱的分子机制研究对于选育抗旱花椒种质尤为必要。本研究以北椒种质资源‘韩椒’和南椒种质资源‘凤椒’为研究对象,测定了干旱胁迫下两种花椒的生理指标,并进行代谢组分析和转录组测序。通过多组学联合分析,揭示了花椒的干旱响应机制,筛选了花椒的抗旱基因,并对两个关键基因(ZbCPD和ZbROT3)进行了功能分析。主要研究结果如下:1.干旱处理降低了花椒叶片中光合色素含量,减小了气孔开度和胞间二氧化碳浓度,抑制了净光合作用效率;提高了过氧化氢(H_2O_2)和丙二醛(MDA)的含量,并增强了过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性;降低了叶片的相对含水量,提高了可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸的含量。在干旱条件下,韩椒比凤椒具有较高的叶片相对含水量、叶绿素含量、渗透物质含量以及胞间二氧化碳浓度,较强的抗氧化酶活性和净光合作用速率,较低的H_2O_2和MDA含量,表明韩椒比凤椒具有较强的抗旱能力。2.转录组分析发现,干旱条件下花椒的差异基因(DEGs)主要富集在植物激素信号转导(ko04075)、淀粉和蔗糖代谢(ko00500)、光合作用-信号蛋白(ko00196)、光合作用(ko00195)、真核生物核糖体生物发生(ko03008)和类黄酮生物合成(ko00941)等通路上。通过代谢组分析,分离并鉴定了花椒叶片中911种代谢成分,主要包括232种类黄酮、131种酚酸、119种脂类、82种生物碱、72种有机酸、56种氨基酸、50种核苷酸、49种木脂素和香豆素、49种糖醇类、24种鞣质和16种萜类。在凤椒中,干旱提高了大多数氨基酸类物质和类黄酮物质的含量;在韩椒中,干旱主要促进了氨基酸物质和生物碱的积累。此外,干旱胁迫均引起了两种花椒中大量的有机酸成分的降解。多组学联合分析筛选了花椒抗旱的关键基因,并揭示了花椒的抗旱响应机制:干旱胁迫引起了花椒植株中活性氧(ROS)的积累,ROS作为次级信号,通过激素信号转导和MAPK信号转导激活响应干旱胁迫的转录因子。转录因子进一步启动了大量下游基因的表selleck化学达,从而导致干旱响应的发生。3.本研究克隆了花椒中的ZbCPD(constitutive photomorphogenesis and dwarfism)基因,其开放阅读框长度为1416bp,编码471个氨基酸,该基因编码的蛋白定位于内质网。通过遗传转化技术和CRISPR技术分别获得了两个ZbCPD转基因拟南芥株系和两个CPD突变体拟南芥株系。CPD的缺失显著降低了拟南芥中油菜素内酯(BRs)的含量,严重影响了拟南芥的正常形态;ZbCPD过表达提高了BRs含量,维持了植株原有的形态。在干旱条件下,ZbCPD通过增强CAT、POD和SOD活性,提高其脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量,降低了H_2AZD2281配制O_2以及MDA含量,减小气孔开度和气孔密度,最终提高了叶片的含水量和植株的成活率。4.从花椒植株中克隆获得了ZbROT3(rotundifolia 3),其开放阅读框长度为1476bp,编码491个氨基酸。亚细胞定位的结果表明ZbROT3蛋白在内质网中发挥功能。通过基因转化技术获得了两个ZbROT3转基因拟南芥株系;通过CRISPR敲除技术获得了两个ROT3拟南芥突变体株系。ROT3的缺失降低了拟南芥中BRs的含量,引起了拟南芥叶柄变短和叶型变宽,减弱了其抗旱能力。ZbROT3过表达提高了拟南芥中BRs的含量。在干旱条件下,ZbROT3过表达通过提高脯氨酸和可溶性蛋白的含量,以及减小气孔开度,抑制水分的散失;通过增强POD和CAT活性,减弱了ROS对细胞的氧Dental biomaterials化伤害程度。ZbROT3过表达显著提高了干旱下叶片的相对含水量以及复水后的成活率,表明ZbROT3过表达增强了植株的抗旱能力。