目的:铁死亡(ferroptosis)是近年来新发现的一种细胞死亡形式,有研究指出糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的发生发展与细胞铁死亡存在一定的联系,但其机制尚未被完全阐明。Xc~-/GPX4通路被证实在细胞铁死亡中起着重要作用,葡萄籽原花青素(grape seed procyanidin extract,GSPE)已被证明对DN具有一定的保护作用,然而GSPE能否通过介导Xc~-/GPX4通路改善细胞铁死亡从而抑制或者缓解DN的发生发展尚不明确。本研究拟建立DN大鼠确认细节及高糖培养的人肾皮质近曲小管上皮细胞(Human Kidney-2,HK-2)模型,从细胞铁死亡的角度,探讨GSPE对DN的保护作用及具体机制。方法:1.体内实验:45只SD大鼠随机挑选10只为对照,其他35只大鼠以高糖高脂饲料联合链脲佐菌素建立DN模型,31只大鼠造模成功。DN大鼠分为DN组(11只)、GSPE组(10只)以及铁抑素-1(Ferrostatin-1,Fer-1)组(10只),GSPE或Fer-1组的大鼠分别以250 mg/kg的GSPE灌胃12周或以2.5μmol/kg的Fer-1腹腔注射12周。测量大鼠基础指标如血糖、尿量、饮水量、体重,肾功能指标如血肌酐、尿素氮、尿白蛋白,氧化抗氧化指标MDA、SOD、GSH。观察肾脏组织切片的HE、PAS、Lillie、Masson染色,同时Western Blot检测纤维化相关蛋白COL I、TGF-β1和α-SMA,铁死亡关键蛋白ACSL4、GPX4、TfR1以及Xc~-/GPX4通路相关蛋白SLC7A11、GSS、GCLM的表达情况。2.体外实验:细胞选用HK-2细胞模拟体内糖尿病环境,使用30mmol/L的葡萄糖建立高糖损伤模型,分别给予erastin(20μmol/L)、Fer-1(1.2μmol/L)以及GSPE(10、20、30 mg/L)干预,或使用erastin(20μmol/L)抑制Xc~-/GPX4通路后施加GSPE干预。使用CCK-8检测细胞活力,荧光检测细胞ROS水平以及线粒体膜电位情况,相应试剂盒检测细胞GSH、MDA含量,Lillie染色检测细胞中Fe~(2+)水平,同时WestEmricasan配制ern Blot检测纤维化相关蛋白COL I、TGF-β1和α-SMA、铁死亡关键蛋白ACSL4、GPX4、TfR1以及Xc~-/GPX4通路的相关蛋白SLC7A11、GSS、GCLM的蛋白表达情况。结果:1.DN大鼠血糖、饮水量、尿量均明显升高,而体重降低(P<0.05),同时血肌酐、尿素氮以及尿白蛋白均明显升高(P<0.05)。肾脏组织SOD和GSH的含量均降低,MDA水平和Fe~(2+)均升高(P<0.05)。HE和PAS结果显示肾脏基底膜增厚,肾小球扩张,囊腔变小,Masson染色显示纤维原沉积显著增加,同时COL I、TGF-β1和α-SMA的表达均明显增加(P<0.05)。铁死亡相关蛋白ACSL4和TfR1的表达均明显增加,而GPX4的表达明显降低(P<0.05),同时SLC7A11及其下游蛋白GSS和GCLM的表达均降低(P<0.05)。以Fer-1和GSPE干预之后大鼠血糖、饮水量、尿量、血肌酐、尿素氮、尿白蛋白均降低,同时体重有所增加(P<0.05)。肾脏SOD、GSH的含量均升高,MDA水平及Fe~(2+)均降低(P<0.05)。纤维原沉积减少,COL I、TGF-β1和α-SMA的表达均降低(P<0.05)。且ACSL4和TfR1的表达均被明显抑制,GPX4的表达明显增强,SLC7A11及其下游蛋白GSS、GCLM的表达均增强(P<0.05)。2.HK-2细胞在施加高糖干预之后细胞存活率明显降低(P<0.05)。细胞中GSH水平下降、线粒体膜电位降低,而MDA、ROS水平以及Fe~(2+)均显著升高(P<0.05)。细胞COL I、TGF-β1和α-SMA的表达均明显增加(P<0.05),同时ACSL4和TfR1的表达均显著增加,而GPX4的表达均明显降低(P<0.05),且SLC7A11及其下游蛋白GSS、GCLM的表达均降低(P<0.05)。而在给予铁死亡抑制剂Fer-1或者不同剂量的GSPE干预之后,细胞存活率提高(P<0.05)。细胞中GSH水平、线粒体膜电位均升高,MDA、ROS水平以及Fe~(2+)均降低(P<0.05)。细胞COL I、TGF-β1和α-SMA的表达均明显下降(P<0.05),同时ACSL4和TfR1的表达均显著降低,而GPX4的表达明显增强(P<0.05),且SLC7A11及其下游蛋白GSS、GCLM的表达均明显增强(P<0.05)。在使用erastin抑制Xc~-/GPX4之后细胞存活率显著降低(Pper-contact infectivity<0.05),同时细胞COL I、TGF-β1和α-SMA的表达均明显增加(P<0.05),同时ACSL4和TfR1的表达均显著增加,而GPX4的表达均明显降低(P<0.05),且SLC7A11及其下游蛋白GSS、GCLM的表达均降低(P<0.05),此时施加不同剂量的GSPE仍能有效提高细胞存活率(P<0.05),使细胞中GSH水平、线粒体膜电位均升高,MDA、ROS水平以及Fe~(2+)均降低(P<0.05),使细胞COL I、TGF-β1和α-SMA的表达均明显下降(P<0.05),同时使ACSL4和TfR1的表达均显著降低,而使GPX4的表达明显增强(P<0.05),且SLC7A11及其下游蛋白GSS、GCLM的表达均明显增强(P<0.05)。结论:DN会出现以肾脏纤维化为表征的肾脏损伤,而铁死亡参与了DN的发生发展,抑制铁死亡可以明显改善DN;GSPE可以通过激活Xc~-/GPX4信号通路抑制肾小管上皮细胞铁死亡的发生而减轻以纤维化为表现特征的糖尿病肾病。