目的:白内障是全球范围内引起失明的主要原因,如何能有效、经济地防控一直是世界性难题,困扰着全世界眼科医生。尽管目前手术干预是非常有效的治疗方法,但尚无治疗药物可用于预防和治疗这种疾病,而且手术干预成本较大,对于欠发达地区及发展中国家因为医疗条件等原因而受限制。我们之前的研究表明,蛋白激酶A(PKA)增加了晶状体中Exit-site infection细胞的间隙连接通讯,这是维持晶状体透明度的重要机制。我们为此寻求一种潜在的白内障预防和延缓的新方法,观察PKA激活剂是否可以通过增强间隙连接蛋白通道/半通道来减少小鼠晶状体中由过氧化氢(H_2O_2)或紫外线B(UVB)诱导的活性氧,更进一步减轻或延缓白内障的发生发展。方法:动物实验:采用四种基因型小鼠:野生型(WT),间隙连接蛋白50敲除小鼠(Connexin,Cx,50 knockout,KO),间隙连接蛋白46敲除小鼠Fer-1使用方法(Cx46KO)和间隙连接蛋白46和50双敲除小鼠(double,d KO)。在体外分离并培养小鼠晶状体后使用H_2O_2或UVB诱导晶状体形成白内障。随后将晶状体分为对照组及实验组进行实验,实验组使用PKA激活剂进行干预。对比晶状体混浊程度观察两组白内障的差异,使用carboxy H2DCFDA探针探测两组晶状体内活性氧reactive oxygen species(ROS)水平。使用商用PKA比色活性试剂盒检测晶状体内PKA水平。使用晶状体组织冰冻切片、免疫荧光染色及蛋白印迹Westernblot检测晶状体内抗氧化蛋白水平。细胞实验:鸡晶状体原代细胞和胚胎成纤维细胞(chick embryonic fibroblast cell,CEF)是天然的缺乏间隙连接蛋白的理想细胞,实验设计所用Cx46、Cx50及Cx46+Cx50突变体的重组RCAS(A)病毒由点突变获得,然后使用高滴度重组RCAS(A)病毒感染鸡晶状体原代细胞和CEF以表达外源性Cx。随后将细胞分为对照组及实验组进行实验,实验组使用PKA激活剂进行干预。使用Annexin V/PI试剂盒双染法检测细胞凋亡/坏死,使用荧光黄(lucifer yellow,LY)/罗丹明-葡聚糖(rhodamine dextran,RD)进行染料转移实验检测间隙连接蛋白通道gap junctions(GJs)功能、染料摄取实验检测间隙连接蛋白半通道Cx Hemichannel功能。结果:间隙连接蛋白(Cx)缺失导致由H_2O_2和UVB诱导的白内障形成明显增加。进而发现PKA激活剂减少了WT、Cx50KO和Cx46KO中H_2O_2或UVB诱发的白内障,但却不减少d KO小鼠的白内障。由此我们探究小鼠晶状体PKA水平,表明PKA激活剂在H_2O_2和UVB存在或不存在的情况下增加了WT、Cx50KO、Cx46 KO和Cx46/Cx50 d KO晶状体中的PKA水平。进行细胞实验证实,PKA激活剂增加Cx46同源以及Cx46和Cx50异源间隙连接蛋白通道和半通道活性。进一步证实,PKA激活剂会降低WT、Cx46和Cx50 KO小鼠晶状体中的活性氧(ROS)水平,但不会降低Cx46/Cx50 d KO晶状体中的ROS水平。PKA激活剂可通过增强半通道(HCs)功能增强谷胱甘肽(GSH)转运并保护晶状体纤维细胞免受H_2O_2诱导的晶状体纤维细胞死亡。间隙连接蛋白敲除晶状体中抗氧化应激基因表达减少。此外,晶状体中连接蛋白(Cx)表达的缺失增加了由H_2O_2和UVB诱导的晶状体混浊,这可能与晶状体中连接蛋白表达的缺失引起抗氧化应激基因表达减少有selleck合成关。结论:1.PKA增加间隙连接蛋白通道/半通道功能并减少晶状体内活性氧水平,通过间隙连接蛋白半通道介导谷胱甘肽转运增加而保护晶状体纤维细胞免受氧化应激损伤。2.PKA激活通过增加晶状体纤维细胞中的连接蛋白通道功能减轻由氧化应激诱导的白内障。3.Cx50KO抗氧化酶水平低于WT和Cx46KO,且小鼠晶状体纤维细胞抗氧化蛋白酶对H_2O_2和UVB的反应不同。因此,我们的研究可以帮助确定一种经济有效的方法来预防和延缓白内障的发生发展。