心血管疾病已成为全球死亡的主要原因之一。内膜增生(Intimal hyperplasia,IH)是血管增生性疾病如动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)、高血压、肺动脉高压(Pulmonary hypertension,PAH)、经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention,PCI)术后再狭窄、动静脉瘘等疾病的主要病理过程。它是血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)的异常增殖迁移以及血管系统中生长因子驱动的细胞外基质蛋白沉积的产物。血管损伤后,活化的内皮细胞(Endothelial cells,EC)、血小板和免疫细胞分泌的生长因子、趋化因子和细胞因子刺激细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的产生和分泌,并减少VSMCs收缩型标记物平滑肌α-肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)和平滑肌22α(SM22α)的表达,而促进合成表型如骨桥蛋白(OPN)和增殖细胞核抗原(PCNA)等的表达。此外,“激活的”VSMCs本身也会产生细胞因子,例如TNFα和MCP-1,从而导致VSMCs增殖和迁移的正反馈级联。之前的研究显示在SMC样细胞重编程和增殖/迁移中起主要作用的信号通路是MAPK、NF-κB和JAK2等通路。目前的研究发现,多种因素和信号通路不同程度地参与了这一过程。然而,内膜增生的发病机制是复杂不明的,尚缺乏有效的干预措施。随着高通量测序以及生物信息学的发展,基因芯片技术、生物大数据分析以及数据挖掘在生命科学研究中发挥着越来越重要的作用。基因芯片技术是近年来常用的检测基因表达变化的技术,具有较高的特异性和敏感性。作为新兴的技术,生物大数据的深入挖掘与分析不但为我们提供了丰富的原始材料,一系列数据的可视化分析还促进了我们对疾病分子机制的研究与挖掘,具有重要而深远的意义。在本篇论文的第一部分,通过对IH相关数据库的挖掘和分析,我们确定了与IH密切相关的DEGs。推动对IH相关靶点的认识和分子机制的研究。核因子kappa增强子结合蛋白(NF-κB)作为一种核转录因子,可调节至少200个与细胞增殖、免疫和炎症反应有关的基因,调控许多过程,包括免疫、炎症和细胞凋亡。NF-κB通路的研究揭示了泛素化的新功能,以及众所周知的靶蛋白质降解的作用。泛素参与该途径至少有三个步骤:NF-κB抑制剂IκB的降解、NF-κB前体的加工以及通过不依赖于降解的机制激活IκB激酶(IKK)。泛素-蛋白酶体途径在NF-κB激活的经典和非经典途径中都起着至关重要的作用。泛素是一种由76个氨基酸组成的8 kDa多肽,具有普遍存在于真核生物中的保守序列。全长泛素共有八个泛素化位点,包括七个赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)和一个N端蛋氨酸残基。在泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)及泛素连接酶(E3)依次相互作用下,泛素C端的甘氨酸的羧基与ε-氨基形成异肽键目标蛋白赖氨酸。然后,额外的泛素分子(称为远端泛素)的Gly 76可以共价连接到泛素本身的泛素化位点(称为近端泛素),以产生多聚泛素链。形成各种类型的蛋白质泛素化,这决定了泛素化底物的命运。通过内部泛素基团的K48连接的多聚泛素链被泛素-蛋白酶体系统用于蛋白质降解信号传导。而K63连接的多聚泛素链呈现出不同的结构,在各种细胞内事件中发挥独立于蛋白酶体的作用,例如炎症信号传导、DNA损伤修复、核糖体蛋白合成、内吞作用和囊泡运输等。研究表明,CYLD和A20两种去泛素化酶(DUB)在NF-κselleckchem BarasertibB活化方面发挥抑制作用主要是通过特异性地去除TRAF6等蛋白的K63连接的多聚泛素链来抑制IKK的激活。BRCC36(BRCA1-BRCA2-containing complex)是 JAMM/MPN+家族重要的成员,能够特异性切割K63连接的多聚泛素链。BRCC36和亚基BRCC45/BRE、MERIT40和Abrol/Abraxas2 形成 BRCC36 异肽酶复合物(BRCC36 Isopeptidase Complex,BRISC)主要在细胞质中参与如炎症、免疫反应、有丝分裂和造血等多种信号通路;与MERIT40、BRCC45/BRE、Abraxas和RAP80组成BRCA1-A复合体,主要在细胞核参与调控DNA损伤修复。在心血管领域的研究发现,BRCC36基因的部分缺失与家族性烟雾病密切相关,而且这类病患同时还伴有早发冠心病、扩张型心肌病等相关表现。敲除BRCC36后,斑马鱼的血管生成出现障碍。重要的是,在一项关于慢性肾脏病血管钙化的研究中发现,BRCC36过表达减少钙化介质存在下的钙沉积,同时伴随收缩蛋白α-SMA上调和磷酸化β-catenin下调。他们表明BRCC36可以与Wnt/β-catenin通路的主要效应蛋白β-catenin相互作用,抑制β-catenin的磷酸化,负向调节细胞信号通路,从而抑制血管钙化。我们课题组之前大量的实验研究不仅证实了 BRCC36通过特异性拮抗TGF-β1/S mad3信号通路的活化来抑制慢性压力负荷所诱导的心脏病理性重构,改善心脏功能;还探讨了血管特异性过表达BRCC36通过激活BMP-PPARγ通路和抑制TGF-β1/Smad3信号通路发挥对慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构的抑制作用。这些研究提示BRCC36在心血管疾病中发挥不可或缺的作用。目前,关于BRCC36能否通过调控NF-κB信号通路来调控VSMCs的增殖、迁移和表型转化,进而发挥拮抗血管损伤诱导的内膜增生及血管重构的研究,国内外尚无明确的报道。五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)是一种从中草药五味子果实中分离出来的活性二苯并辛二烯木酚素,在抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗焦虑、保肝等方面具有重要作用。大量实验表明,Sch B可通过抑制脂质的过氧化,减少丙二醛和乳酸脱氢酶所释放的活性氧,提高细胞内的超氧化物歧化酶(SOD)的水平,进而直接的清除自由基,发挥抗氧化作用。分子机制研究表明,SchB可以有效减少炎症信号通路的激活包括NF-κB通路和MAPK/Erk/p38/Jnk通路。此外,Sch B通过调节哮喘小鼠模型中的NF-κB信号通路来减轻气道炎症。目前关于Sch对内膜增生的影响知之甚少,相关机制的研究尚不清楚。基于上述研究,我们首先在第一部分初步利用生物信息学方法鉴定了关键的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),分析其潜在的分子机制,并挖掘小鼠内膜增生数据集中IH的潜在靶点。然后分析人的冠状动脉粥样硬化数据集、小鼠颈动脉结扎数据集及PDGF-BB刺激人膀胱平滑肌细胞的数据集中的BRCC36的表达;同时通过收集临床标本,结扎左颈动脉构建小鼠血管内膜增生模型及PDGF-BB诱导VSMCs增殖迁移细胞模型,检测BRCC36予以验证。其次,我们在第二部分利用血管特异性过表达BRCC36转基因小鼠及血管特异性敲除BRCC36小鼠进行颈动脉结扎诱导内膜增生模型,探讨去泛素化酶BRCC36对血管损伤后血管重构的影响;并且通过原代培养大鼠的主动脉平滑肌细胞和过表达/消减BRCC36的重组腺病毒,在细胞水平探讨BRCC36对PDGF-BB诱导的VSMCs表型转化、增殖及迁移和NF-κB信号通路的作用。最后,在第三部分,我们首先对SchB与小鼠BRCA1-A复合物进行分子对接,发现Sch B可以与BRCA1-A复合物中的多个位点发生结合,其中以催化亚基BRCC36的Lys85位点结合最为稳定。然后,我们探讨Sch B对BRCC36表达的影响及对血管损伤所致的内膜增生和血管重构的机制研究,以期寻找能够直接转化在临床上达到治疗IH所致的再狭窄等血管增生性疾病的药物。研究内容共分为三个部分:第一章内膜增生中关键差异表达基因的生物信息学鉴定与验证目的:本研究旨在通过GEO中不同物种的血管增生性疾病的数据集进行分析,明确BRCC36的表达变化,筛选出与血管内膜增生相关的潜在靶点和机制。方法:从 Gene Expression Omnibus(GEO)数据库下载 GSE56143、GSEtextual research on materiamedica100927、GSE182291和GSE52488数据集的基因表达谱。对GSE56143数据集采用功能富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析和转录因子(TF)-靶基因调控网络来揭示DEGs的生物学功能。并对前10个关键DEGs在mRNA和蛋白质水平的表达验证。此外,对GSE100927、GSE182291和GSE52488的数据集进行统计学分析BRCC36的mRNA水平的表达。然后,采用RT-qPCR及Western blot检测方法验证人、小鼠和细胞模型中BRCC36的mRNA及蛋白水平的表达。结果:1.从数据集GSE56143筛选出373个DEGs(199个上调基因和174个下调基因)。这些DEGs在免疫炎症、增殖、迁移、细胞黏附等信号通路中明显富集,主要与细胞粘附分子和肌动蛋白细胞骨架调控相关。并且它们主要受Nfkb1、Sp1和Trp53转录因子的调节。前 10 个 DEGs(Ptprc、Fn1、Tyrobp、Emr1、Itgb2、Itgax、CD44、Ctss、Ly86和Aif1)在PPI网络中被作为关键DEGs。对这些关键DEGs在mRNA和蛋白水平上的验证与上述生物信息学分析结果一致。2.通过对三组数据集GSE100927、GSE182291和GSE52488的分析发现BRCC36在三组数据集的mRNA水平都是升高的,人AS的数据集GSE100927显示VSMCs收缩表型标志物如SM22α、SMMHC、SMOOTHELIN、CALPONIN在转录组水平上是降低的,而VSMCs合成表型标志物OPN、PCNA、CYCLIND1、KI67、MMP9是升高的。3.临床相关疾病标本及内膜增生模型验证BRCC36的mRNA及蛋白水平都是增高的。结论:本研究确定了参与IH的关键基因及分子机制,为接下来IH的研究提供了方向;并且验证了去泛素化酶BRCC36在血管增生性疾病中的高表达,提示BRCC36可能参与了血管损伤所致的内膜增生及血管重构的过程。第二章去泛素化酶BRCC36对血管损伤诱导的内膜增生及血管重构的作用及机制研究目的:探讨BRCC36对血管损伤后血管重构的影响及其作用机制。方法:1.选取SPF级8-12w的雄性血管特异性BRCC36过表达小鼠,BRCC36敲除小鼠及C57BL/6野生型小鼠,采用单侧颈总动脉结扎制备动脉损伤模型,于结扎后第28天取材测量新生内膜面积,采用Weigert进行形态学分析,采用免疫组化检测α-SMA、OPN、MMP9、PCNA等相关蛋白的表达。2.分离培养原代大鼠VSMCs,分别给予感染BRCC36腺病毒、BRCC36-shRNA腺病毒以及对照病毒48h后,饥饿处理后给予血小板衍化生长因子(PDGF-BB,20ng/ml)刺激24h,采用划痕实验、Transwell小室分析细胞迁移情况,采用流式细胞术检测细胞增殖,采用Western Blot检测VSMCs相关表型蛋白α-SMA、sm22α、smoothelin、OPN、MMP9、PCNA 及 NF-κB 通路因子的表达。结果:1.在动物水平上,与假手术组相比,颈动脉结扎后BRCC36-Ko组小鼠的颈动脉新生内膜面积及内膜/中膜的比值明显增加;IHC显示BRCC36-Ko组小鼠颈动脉组织中VSMCs收缩型蛋白α-SMA表达降低,而合成型蛋白OPN、PCNA和MMP9明显升高;在细胞水平上,Western blot显示消减内源性BRCC36的表达加重了PDGF-BB诱导的VSMCs的收缩型蛋白(α-SMA、Smoothelin、SM22α)的降低,促进了 PDGF-BB诱导的VSMCs的合成蛋白OPN、PCNA和MMP9的升高;同时,流式细胞术、Transwell及划痕结果显示消减内源性BRCC36促进了细胞增殖和迁移水平。PDGF-BB刺激VSMCs后,NF-κB信号通路激活,P65入核发生磷酸化;内源性消减BRCC36后,其信号通路活性进一步增强。2.与假手术组相比,过表达BRRC36小鼠显示出减少的内膜增生面积,高表达的收缩表型及低表达的合成表型;体外研究结果进一步证实,过表达BRCC36促进收缩型蛋白的表达,降低VSMCs合成型蛋白的表达,且显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖及迁移。同时,过表达BRCC36抑制了NF-κB通路相关因子的活化。结论:去泛素化酶BRCC36通过抑制NF-κB信号通路抑制VSMCs的增殖、迁移及表型转化,进而抑制血管损伤所致的血管重构。第三章五味子乙素(Sch B)对血管损伤诱导的血管重构的保护作用及BRCC36的影响目的:阐明Sch B对血管损伤后血管重构的作用机制及对BRCC36的影响。方法:1.选取SPF级8-12w的雄性C57BL/6野生型小鼠作为研究对象,采用颈总动脉单侧结扎制备动脉损伤模型,实验共分为三组分别为假手术组,颈动脉结扎损selleck合成伤组和Sch B干预组。Sch B干预治疗后取材,采用Weigert进行形态学分析并测定新生内膜面积,采用IHC检测α-SMA、OPN、PCNA和MMP9相关蛋白的表达。采用WB检测BRCC36的水平变化。2.分离培养原代大鼠VSMCs,予以不同剂量的Sch B预处理1h后,再给予20 ng/ml浓度的PDGF-BB刺激24h。采用流式细胞术、CCK-8、Western blot、划痕实验、RT-qPCR、Transwell、SOD、MDA 检测不同浓度的 Sch B 对 VSMCs增殖、迁移、表型、氧化应激、炎症相关因子的影响及对BRCC36表达的影响。结果:1.在体实验结果显示,与结扎组相比,Sch B治疗组的新生内膜面积被显著抑制;同时,IHC检测VSMCs收缩表型α-SMA的表达显著增高,合成表型OPN、增殖表型PCNA、迁移表型MMP9显著降低。Western blot检测到Sch B促进了 BRCC36的表达。2.细胞水平进一步证实,不同浓度的Sch B分别在不同程度上促进VSMCs中收缩蛋白α-SMA的表达,抑制VSMCs的增殖(PCNA)、迁移(MMP9)及表型转化(OPN)。Sch B通过促进SOD的产生和减缓MDA的释放,以减轻血管损伤所致的氧化应激反应。此外,SchB还通过抑制NF-κB信号通路的活性来抑制血管损伤所致的炎症反应,表现为促炎因子TNF-α、IL-6的mRNA水平及P65活性的降低。结论:在本研究中,Sch B通过促进BRCC36抑制PDGF-BB诱导的NF-κB信号通路的活化进而抑制VSMCs的增殖、迁移和表型转化,最终拮抗血管损伤所致的内膜增生及血管重构。