褐藻胶是海洋中最丰富的植物海藻的主要组成成分之一。褐藻胶可以通过化学法、物理法和生物酶法转化为褐藻寡糖,但只有生物酶法生产的褐藻寡糖生物活性最好。因此,开发高效降解褐藻胶生产褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶具有研究意义。本研究通过序列比对与结构分析对来自于假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.Alg6B)的褐藻胶裂解酶基因Alg2944进行定点突变并获得比酶活和热稳定性提高的突变体。通过分子动力学模拟对突变体和野生型进行结构与性质分析,解释比酶活和热稳定性提高提高机制。将最优突变体通过信号肽筛选成功在枯草芽孢杆菌中分泌表达。工作的主要内容如下:(1)重组菌株E.coli BL21(DE3)-p ColdⅡ-Alg2944诱导产酶条件优化。结果表明:诱导前的预培养时间5 h左右;诱导剂IPTG在培养基中最适终浓度1.0 mmol·L~(-1);最适钙化合物CaCl_2,最适CaCl_2浓度10 mmol·L~(-1);诱导时间12 h。(2)突变株筛选及酶学性质表征。利用序列比对与结构分析对褐藻胶裂解酶Alg2944定点突变并获得比酶活较高突变体N145D、A195F、A195I、A195L和F246Y,比酶活分别为8559.2 U·mg~(-1)、12938.3 U·mg~(-1)、9753.3 U·mg~(-1)、12854.2 U·mg~(-1)和8291.7U·mg~(-1),较野生型分别提高了21.9%、84.2%、38.9%、83.0%以及18.1%;野生型和突变体N145Dwww.selleck.cn/products/Taurine、A195F和F246Y最适反应温度为40℃,突变体A195L和A195I的最适反应温度为45℃,突变体A195L和A195I在35℃与40℃下热稳优于野生型;最适p H 8.0,在p H 7.0～8.0之间p H稳定性较强;genetic constructsCa~(2+)、Mg~(2+)、Ba~(2+)对酶活有明显激活作用,Ag~+、Zn~(2+)、Co~(2+)对酶活有明显抑制作用,金属离子螯合剂EDTA明显抑制Alg2944活性。(3)分子动力学模拟。A195L在突变位点附近均方根波动(Root Mean Square Fluctuation,RMSF)低于野生型Alg2944,解释了A195L热稳优于野生型的原因;结合自由能计算发现A195L(-59.9 kcal·mol~(-1))高于Alg2944(-33.7 kcal·mol~(-1)),解释了在K_m方面A195L(2.137 mg·m L~(-1))低于Alg2944(4.122 mg·m L~(-1))的原因;溶剂可及表面积(SolvenMCC950作用t Accessible Surface Area,SASA)计算发现A195L(180.34 nm~2)低于Alg2944(193.92 nm~2),说明Leu195为催化中心入口提供了疏水袋。总之,通过A195L与野生型分子动力学分析证明了位于催化口袋入口环区的刚性与疏水性对其催化活力很重要。(4)A195L在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)中表达和酶解产物分析。通过信号肽筛选,该酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达的最适信号肽为Npr B,在37℃下摇瓶发酵24 h发酵液上清酶活达1237.4 U·m L~(-1);酶解条件优化得出最适底物浓度10 mg·m L~(-1),在500μL的反应体系中最适酶添加量为240 U。薄层层析法(TLC)对酶解产物分析得产物为单糖、二糖以及三糖,其中单糖和二糖为最终产物。