目的:创伤性脑外伤(traumatic brain injury,TBI)会导致进行性神经炎症和变性,引发多种程序性细胞死亡,进而引发运动、记忆和认知情感功能障碍,是临床医学和法医学实践中最常见的损伤。细胞焦亡是脑外伤急性期出现的一种程序性细胞死亡,主要效应是在细胞死亡的同时释放炎性介质从而引发机体的炎症反应。而铜离子在抗炎和抗氧化应激方面发挥了重要作用,多种神经系统疾病的发生都与铜稳态失衡有关,而铜离子在脑外伤后的作用并未有报道。本研究旨在探究铜离子及其稳态调控在轻度TBI中的作用以及负载氧化铜的静电纺丝支架如何通过调控铜稳态实现其神经保护作用。方法:本课题组首先建立小鼠轻度TBI模型,通过电感耦合等离子体质谱(ICPMS)检测伤侧皮质内1d后铜离子浓度的变化,再通过蛋白免疫印迹实验检测了伤侧皮质组织中铜转运 ATP 酶 1(Copper-transporting ATPase 1,ATP7A)、铜转运体 1(copper transporter 1,CTR1)、酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)、超氧化物歧化酶铜分子伴侣(Copper chaperone for superoxide dismutase,CCS)以及超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase,SOD1)在损伤后不同时间点(6h,12 h,1d,2d,3d,7d,14 d)的表达情况,并选择1 d,3d,7 d进行免疫荧光实验观察皮质组织中ATP7A在神经元,星形胶质细胞和小胶质细胞中的表达。并在TBI 1 d后,观察CCS,SOD1与medication therapy management神经元,星形胶质细胞和小胶质细胞共定位以及抗氧化剂1铜伴侣蛋白(Antioxidant 1 copper chaperone,Atox1),人细胞色素 C 氧化酶 17(Human COX17 cytochrome c oxidase assembly homolog,COX 17)在神经细胞中的表达。为了探究外源性铜离子对轻度TBI是否有神经保护作用,将聚已内酯(PCL)和明胶(Gelatin,Gel)混合液中掺入氧化铜颗粒,制备负载氧化铜(CoperoxY-27632 IC50dide,CuO)的静电纺丝支架,以实现铜离子持续低浓度释放。通过傅里叶变换红外光谱分析仪、扫描电子显微镜和水接触角测试分析其表征,同时用抑菌实验测试其抗菌功能。选择负载氧化铜的支架作为铜离子的递送载体,探究外源性铜离子对神经细胞焦亡的影响。通过免疫印迹实验检测原位给药后1d伤侧皮质组织,检测不同给药时间和氧化铜浓度下焦亡(pyroptosis)相关蛋白如NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptors family pyrin domain containing 3,NLRP3),gasderminD(GSDMD),半胱天冬酶-1(Caspase1)和凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-related dot-like protein,ASC)表达,以确定最佳植入的时间窗和浓度。为了进一步验证铜的作用,给予铜离子螯合剂四硫代钼酸铵(tetrathiomolybdate,TTM),通过分子生物学(免疫印迹和免疫荧光检测上述焦亡相关蛋白的细胞定位)、组织形态学(尼氏染色)以及行为学(运动功能实验、水迷宫、旷场实验)等研究外源性铜离子对细胞焦亡的作用以及神经保护功能。最后,对外源性铜离子是否影响轻度脑外伤后血液、组织内总铜含量进行研究,采用ICPMS检测轻度脑外伤给予外源性铜离子治疗1 d后血液和皮质内总铜浓度的变化;随后,通过免疫印迹实验和免疫荧光检测皮质组织中的ATP7A、CTR1、CCS、SOD1和TH的表达和与神经元定位情况,探究给予外源性铜离子是否通过调节轻度TBI后铜稳态实现其神经保护作用。结果:(1)在轻度脑外伤后,伤侧皮质组织中铜离子浓度下降,而CTR1和ATP7A的表达均呈上升趋势,在14d仍高于基线水平;CCS、SOD1、TH均在12h-1 d左右达到顶峰,之后逐渐下降,14 d基本恢复基线水平。正常皮质组织中的ATP7A主要定位于小胶质细胞,在轻度TBI后1d下降,3d恢复基线水平;TBI后ATP7A在神经元细胞中表达升高,直至7 d恢复基线水平;而在星形胶质细胞中,TBI后3 d内ATP7A阳性的细胞逐渐增加,在7d仍高于基线水平。损伤后1d,ATP7A主要表达在神经元。正常皮质组织的CCS在小胶质细胞和星形胶质细胞中表达较多,SOD1主要位于小胶质细胞;TBI后,伤侧皮质中的CCS主要表达于神经元和小胶质细胞,SOD1主要位于神经元和星形胶质细胞。TBI后,伤侧皮质神经元中的COX17和Atox1表达上升。(2)负载CuO后,PG的形貌特征没有发生明显变化,亲水性略微降低;PG支架在负载CuO后显示出了一定的抗菌能力。植入负载CuO的电纺丝支架可以通过给予外源性铜离子降低神经细胞焦亡水平,减轻神经细胞的变性,最佳的给药时间窗和浓度分别是伤后6h和0.5%;且外源性铜离子能改善运动功能障碍、空间记忆能力和认知情感障碍,同时给予TTM后外源性铜离子的保护作用消Z-IETD-FMK研究购买失。(3)轻度TBI后,伤侧皮质内总铜水平降低,给予外源性铜离子可以恢复皮质内铜含量,升高血液内的总铜水平,铜离子螯合剂TTM则起到了相反的作用。给予外源性铜离子可以降低轻度脑外伤皮质内ATP7A、TH、CCS、SOD1的表达,尤其是在神经元内,TTM可以抵消这种趋势,表明外源性铜离子恢复了细胞内铜稳态失衡。结论:(1)轻度TBI后伤侧皮质中铜离子浓度降低,铜蛋白的表达呈现时间依赖性的上调趋势,提示轻度TBI存在铜稳态失衡和铜需求增加。(2)负载CuO的静电纺丝支架实现了脑局部缓慢、持续、低剂量供铜,并且从分子生物学、组织病理学和行为学三个水平证实其能够减轻轻度TBI后的神经元焦亡,发挥神经保护作用(3)给予外源性铜离子可以升高血液内铜浓度,恢复轻度脑外伤后皮质内的总铜水平和神经元内铜代谢水平,改善铜稳态。