猪是重要的农业动物。长期以来,猪肉占据我国肉类消费的60%以上,对提高国民生活质量至关重要。此外,猪在医学领域具有巨大潜力,可成为重要的医学模型和理想的人类器官移植供体。基于其具备的畜牧学和医学应用价值,在猪上应用基因编辑技术也具有双重价值:不仅可以缩短改良家猪的遗传育种周期并提高遗传稳定性,还可为人类疾病研究提供临床前证据和治疗方案的测试,广泛应用于多种人类疾病的研究。研究表明ZBED6作为转录因子,在调节各种细胞过程和细胞状态的基因程序中发挥关键作用,在生理条件下与哺乳动物肌肉生长密切相关,在多种疾病状态下也起着重要作用。因此,ZBED6基因敲除猪在畜牧学和医学研究中具有双重应用潜力。本研究以我国特色的巴马小型猪为研究对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建ZBED6基因敲除猪,通过高通量测序、生物信息学技术、分子生物学以及细胞生物学方法,阐明ZBED6在调控猪骨骼肌生长和缓解脓毒症肌萎缩方面的分子机制,并评估ZBED6作为促进家猪肌肉生长和缓解脓毒症肌萎缩双重靶点的可行性。本研究主要结果如下:1.ZBED6敲除促进猪肌肉生长,肌纤维肥大,增加产肉量,对肉品质无显著影响。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建ZBED6敲除猪,进一步扩大繁育至F8代,进行后续试验。生长性状监测显示8月龄时,与野生型猪相比,ZBED6敲除猪平均体重增加了15.180%(P=0.003),体长、体宽及胸围显著增大,提高饲料效率;进一步屠宰试验表明ZBED6敲除猪的胴体瘦肉率增加13.360%,胴体脂肪率降低6.170%,而两个基因型猪的骨率和皮率相似,这表明ZBED6敲除猪胴体重增加的主要原因是骨骼肌重量的增加,即产肉量增加。组织学检测发现,与野生型猪相比,ZBED6敲除猪的产肉量增加主要是由于单个肌纤维面积增大引起的,与肌纤维的数目无关。对8月龄野生型猪和ZBED6敲除猪的胸最长肌进行肉品质相关性状(红度、蒸煮损失、氨基酸和脂肪酸组成等)的检测显示ZBED6敲除在增加产肉量的同时不影响肉品质。2.ZBED6敲除促进ISLR表达,激活下游的经典Wnt通路,从而促进了成肌细胞分化和肌管形成,进而促进肌肉生长。为探究ZBSB431542说明书ED6促进猪骨骼肌生长的潜在机制,本研究首先进行多物种多组织转录组数据集与ZBED6基因进化数据的联合分析。结果显示,ZBED6基因在哺乳动物骨骼肌中具有跨物种的保守性。利用多组学技术进行联合分析,筛选出能够与ZBED6特异性结合的基因,并通过双荧光素酶实验验证ISLR是ZBED6直接调控的靶基因。进一步利用转录组学、细胞生物学和分子生物学实验,发现ZBED6通过负调控ISLR表达,提高Wnt信号通路关键蛋白DVL2的表达,进一步促进β-catenin进入细胞核,激活下游的经典Wnt通路,并增加MYOG的蛋白表达,从而促进成肌细胞分化介导的肌肉生长。3.肌肉组织中ZBED6的表达增加,与脓毒症肌肉萎缩有关。ZBED6敲除显著缓解猪脓毒症肌萎缩。为探索ZBED6缺失猪的医学应用潜能,本研究探究了ZBED6在常见脓毒症肌肉萎缩中的作用。该项疾病的深入研究需要合适的动物模型。本研究首创一种新型盲肠结扎穿刺手术方案,显著降低死亡率,成功再现人类脓毒症的发生和发展全过程和猪脓毒症肌萎缩症状,可用于深入探讨脓毒症肌肉萎缩的机制。为明确ZBED6与脓毒症肌肉萎缩之间的关系,本研究综合运用影像学、病理组织学及多种分子生物学手段对脓毒症患者和脓毒症猪模型样本进行跨物种高维IP immunoprecipitation度联合分析。结果显示,与对照组相比,脓毒症患者和脓毒症猪肌肉组织中的ZBED6表达水平均显著上升。进一步进行肌肉超声、血清生化及分子生物学肌萎缩指标检测,结果显示ZBED6表达与脓毒症肌萎缩密切相关。为深入探究ZBED6在脓毒症肌肉萎缩中的作用,本研究创建ZBED6敲除猪脓毒症模型,结果显示ZBED6敲除减轻脓毒症导致的体重下降(P<0.001),显著减少肌肉萎缩(P<0.001),对脓毒症导致脂肪重量减少没有显著影响。进一步对脓毒症猪全身不同部位的肌肉组织进行组织学检测,结果显示ZBED6敲除显著减轻全身各个部位肌肉的肌纤维面积的萎缩程度。此外,通过肌纤维特异性免疫荧光染色进一步分析,表明ZBED6敲除显著减少Ⅱ型肌纤维的萎缩程度,而Ⅰ型肌纤维的萎缩程度较小且没有明显差异。利用血清生化、RT-q PCR、免疫印迹及SUn SET技术分析脓毒症后猪肌肉组织中的蛋白质分解与合成代谢状态,结果表明ZBED6敲除减少脓毒症导致的蛋白质分解,缓解蛋白合成代谢障碍,纠正肌肉蛋白质代谢紊乱,从而缓解脓毒症肌萎缩。4.ZBED6敲除通过上调靶基因DOCK3的表达,激活下游的RAC1/PI3K/AKT信号通路,从而缓解脓毒症肌萎缩。为探究ZBED6敲除缓解不同部位脓毒症肌萎缩的作用机制,本研究采集脓毒症条件下野生型猪和ZBED6敲除猪全身9个不同部位肌肉进行转录组测序,并对猪肌肉组织进行ZBED6的Ch IP-seq测序,随后进行联合分析,结果显示ZBED6的四个潜在调控靶基因分别为SOX18、DOCK3、C14orf39和G0S2。其中,DOCNVP-TNKS656供应商K3不仅是RNA-seq中差异表达倍数最高的基因,也是Ch IPseq中ZBED6靶向程度最强的基因;RT-q PCR和免疫印迹实验结果显示,ZBED6敲除猪的肌肉组织中DOCK3蛋白的表达显著上调。进一步利用双荧光素酶和Ch IPPCR实验发现,ZBED6直接结合DOCK3启动子序列,从而负调控DOCK3转录活性。利用全身9个不同部位肌肉RNA-seq的差异表达基因进行KEGG富集分析,整合结果表明仅PI3K/AKT信号通路在9个肌肉部位中均显著富集在前20名的信号通路中;进一步通过细胞实验验证ZBED6敲除导致DOCK3/RAC1/PI3K/AKT信号通路的激活。与细胞实验结果一致,与野生型猪脓毒症组相比,ZBED6敲除猪脓毒症组的骨骼肌DOCK3和RAC1-GTP蛋白表达显著上调,从而激活了PI3K/AKT信号通路。总之,本研究首次证明ZBED6敲除激活ISLR-Wnt信号通路,促进猪肌肉的生长,提高产肉量,且对肉品质没有负面影响。此外,首创新型盲肠结扎穿刺手术方案,创制新型猪脓毒症模型,并基于该模型首次发现ZBED6与脓毒症引起的肌肉萎缩高度相关,阐明ZBED6敲除激活DOCK3/RAC1/PI3K/AKT信号通路,以缓解脓毒症引起的肌肉萎缩。本研究通过对ZBED6基因的挖掘,为提高家猪产肉性状的分子靶标以及肌萎缩疾病治疗的研究提供重要线索,为猪品种改良及人类疾病研究等“一猪两用”工作带来新的应用前景。