研究背景:放射性肠炎(Radiation Enteritis,RE)是盆腹腔等恶性肿瘤放疗过程中消化系统最严重的副作用之一,可导致患者对放射治疗的耐受性和生活质量下降。随着放疗技术在恶性肿瘤中的广泛应用,其对癌旁组织的副作用越来越受到关注,肠道上皮细胞由于快速增殖而对辐射敏感,接受放射治疗的部分患者会发生放射性肠炎。目前为止,临床上治疗放射性肠炎的抗生素和抗炎剂等药物,效果不佳,相关基础研究和药物开发不理想,不能进行有效的预防和治疗,随着恶性肿瘤放射治疗患者数量的增加,放射性肠炎的发生率也在增加。关于急性放射性肠炎模型的建立都是基于动物实验,以鼠类、犬类、兔类为主,但因实验动物选取、造模仪器、摆位方式,辐照部位和辐照剂量的不同、实验结果重复性差等影响,建立合适的放射性肠炎模型成为研究的关键。本研究一方面通过不同剂量和不同时间点建立放射性肠炎模型,另一方面在细胞水平初步探索辐照诱导正常肠上皮细胞死亡的类型及分子机制,旨在为放射性肠炎的发生和治疗提供一定的理论基础。第一部分建立急性放射性肠炎小鼠模型并研究其肠上皮细胞死亡及炎性因子变化目的:用不同剂量的医用直线加速器6 MV-X射线照射C57BL/6小鼠,建立急性放射性肠炎小鼠模型并研究其肠上皮细胞死亡及炎性因子变化。方法:取SPF级雄性6-8周龄C57BL/AMG510使用方法6小鼠23只,随机分为对照组(n=3)和6、12、15、18 Gy(n=5)不同剂量辐射组,观察小鼠15天存活率和体重变化情况。另取60只小鼠,随机分为对照组和6 Gy、12 Gy、15 Gy(n=15)不同剂量辐射组,分别在第1、3、7天颈椎脱臼处死各5只小鼠,取末端回肠组织做病理切片,进行HE染色,MAnteromedial bundleasson染色,观察其病理组织学变化,建立急性放射性肠炎小鼠模型。采用RT-q PCR方法检测肠组织中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和促纤维化生长因子TGF-β1的m RNA相对表达量变化,采用免疫组化方法检测肠组织cleavedPARP的表达,观察辐照后炎症因子变化及肠组织细胞死亡情况。结果:与对照组相比,各辐射组小鼠照射后出现不同程度的健康问题和体重降低状况,15 Gy辐射组尤为显著但无小鼠死亡情况,18 Gy辐射组小鼠15天内死亡率为60%。15 Gy较对照组小鼠回肠绒毛高度降低,隐窝数目减少、深度变浅,隐窝腔变大,肠纤维化更明显,而6 Gy及12 Gy辐射组相应表型不明显。照射后第3天,6 Gy、12 Gy、15 Gy辐射组较对照组促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和促纤维化生长因子TGF-β1有显著性变化,并且免疫组化结果显示15 Gy辐射组肠组织cleaved-PARP阳性表达更显著。因此,建立急性放射性肠炎的辐射条件是:医用型直线加速器6 MV-X射线,源皮距100 cm,15 Gy一次性腹部照射。结论:6 MV-X射线一次性腹部照射,大体观察和病理切片表明15 Gy和18 Gy辐射组具有临床急性放射性肠炎的症状,18 Gy辐射组小鼠出现死亡情况,不能为进一步实验研究selleck提供模型,15 Gy可作为急性放射性肠炎小鼠模型的最佳照射剂量。随着辐照剂量增加,肠隐窝细胞损伤逐渐严重,炎症因子m RNA表达水平也增加,肠组织免疫组化cleaved-PARP表达阳性。第二部分在细胞水平上初步探究辐射诱导肠上皮细胞死亡的分子机制目的:在细胞水平上通过辐照IEC-6细胞确定其死亡类型,并进一步探究细胞死亡发生的分子机制。方法:选取IEC-6细胞系,用医用直线加速器6 MV-X射线以5 Gy、8 Gy、10 Gy,12 Gy不同的剂量去辐照细胞,采用CCK8法和PI单染两种方法,确定最佳辐照剂量和最佳观察时间点。在此基础上采用活性氧ROS和流式Annexin V/PI双染法实验,初步确定辐射诱导肠上皮细胞的死亡方式以及诱导细胞死亡方式的分子机制。结果:在细胞水平,CCK8实验表明,IEC-6细胞在12 Gy照射条件下,72 h时细胞活力下降到50-60%左右。PI单染实验表明,IEC-6细胞在12 Gy照射条件下,24 h时细胞死亡率在40%左右。综合两种实验方法,同时结合相关文献报道,细胞生存率60%最佳,选择6 MV-X射线医用型直线加速器,放射源距细胞100 cm,一次性照射12 Gy,24 h为IEC-6细胞的造模剂量和时间。Western Blot结果显示细胞辐照后发生了caspase3的活化,并且加入caspase抑制剂Q-VD-OPh后,细胞中ROS释放量和细胞凋亡显著降低,细胞活力显著增加,活化的caspase3蛋白表达量减少。结论:医用直线加速器6 MV-X射线一次性照射细胞,CCK8实验结果与PI单染实验结果综合表明,12 Gy,24 h为IEC-6细胞的造模剂量和时间,并且辐照诱导肠上皮细胞发生了细胞凋亡,与caspase3激活有关。图[16]表[10]参[78]