研究背景:电离辐射引发多种细胞死亡方式,导致多器官损伤。肠道是电离辐射敏感组织,其中尤以小肠最为敏感。目前Imidazole ketone erastin抑制剂缺乏对辐射引发的肠道细胞损伤有效的治疗方法。细胞焦亡是一种最近发现的细胞程序性死亡方式,其主要通过激活Caspases切割Gsdermins(GSDMs)家族蛋白,释放N末端,结合细胞膜并打孔,导致细胞膨大死亡。GSDMs家族主要包含五位成员,Gsdermins D(GSDMD)和Gsdermins E(GSDME)目前研究最多,GSDME还被发现参与肿瘤焦亡,并介导凋亡向焦亡的转化。已有研究表明,细胞焦亡参与辐射诱导肠损伤调节,并发挥重要作用,有关细胞焦亡的发生和上游分子如何调控目前多有研究,但不同种属、肠细胞系间GSDMs其他成员激活情况以及切割后的N末端与细胞膜结合打孔出泡导致细胞死亡如何被调控所知不多,需要进一步研究。研究目的:已知细胞焦亡直接参与辐射诱导肠损伤调节,深入研究辐射诱导细胞焦亡在不同种属、肠细胞系中生物效应及辐射诱导鼠肠上皮细胞焦亡上下游调控机制具有重要意义,可以为辐射诱导肠损伤临床防治提供新思路。研究方法:1.为验证NEAT1调控辐射诱导肠细胞焦亡通过mi R-448/GSDME途径,选择人结肠癌细胞HCT116辐射不同时间、剂量,q PCR分析辐射后48h HCT116细胞中凋亡相关基因Caspase-9、BCL2、Bcl-xl和Bax等的表达。基于Pub Med GEO数据库分析mi R-448与GSDME之间的联系,筛选并验证mi R-448靶向调控GSDME。2.为探究辐射诱导的细胞焦亡在不同种属、肠细胞系中细胞焦亡效应,选择人正常结肠上皮细胞NCM460、小鼠正常小肠上皮细胞MODE-K、人结肠癌细胞HT-29和HCT116电离辐射不同时间、不同剂量,Western Blot检测细胞焦亡标志蛋白GSDMs家族各成员表达和激活情况。3.为探究辐射诱导肠上皮细胞焦亡上下游分子调控机制,依据辐射诱导鼠肠上皮细胞焦亡辐射和剂量阈值,成功构建辐射诱导小鼠正常肠上皮细胞焦亡模型。经ONT全长转录组测序,筛选细胞焦亡相关的差异基因。通过生物信息学方法分析与辐射诱导细胞焦亡相关biomedical optics的差异基因富集通路,q PCR验证测序分析结果。4.为探究辐射诱导肠上皮细胞焦亡出泡过程是否与高尔基、囊泡运输功能有关,构建鼠源Gsdme-N端表达载体后,在小鼠正常肠上皮MODE-K细胞中过表达,观察焦亡小泡形态,统计焦亡小泡数目,检测出泡时间及高尔基、囊泡转运过程中富集基因的表达。高尔基、囊泡运输功能抑制剂处理MODE-K细胞,破坏细胞的蛋白运输功能后,观察焦亡小泡形态,检测出泡时间及高尔基、囊泡转运过程中富集基因的表达。研究结果:1.验证了lncRNA NEAT1通过调节mi R-448表达调控GSDME介导的辐射诱导人结直肠癌细胞HCT116细胞焦亡。2.辐射可以诱导人正常上皮细胞NCM460、人结肠癌细胞HT-29以及鼠正常肠上皮细胞MODE-K发生细胞焦亡。辐射诱导不同肠上皮细胞焦亡后,GSDMs蛋白家族成员的表达和激活情况各不相同。NCM460细胞中仅GSDME蛋白出现激活;HT-29细胞中除了GSDME其他GSDMs家族成员均出现Belnacasan molecular weight激活;MODE-K细胞中Gsdma和Gsdme出现激活。3.将Gsdme-N蛋白激活状态定义为细胞焦亡状态,成功构建辐射诱导肠上皮细胞焦亡模型,确定了细胞焦亡参与的辐射诱导肠损伤的时间(>48h)和剂量(>4Gy)阈值。测序分析得到49个“非焦亡状态”差异基因,383个“焦亡状态”差异基因。GO分析发现,焦亡状态下差异基因主要富集于囊泡、囊泡-高尔基体蛋白质运输、免疫等生物过程以及蛋白质运输和病毒感染等信号通路。“非焦亡”状态下差异基因主要富集于细胞凋亡、基因表达等生物过程以及病毒感染、细胞自噬等信号通路。4.过表达小鼠Gsdme-N表达载体后直接激活细胞焦亡状态,过表达后12h焦亡出泡显著增加。高尔基、囊泡运输功能抑制剂处理后6h焦亡出泡数量显著增加。研究结论:本文重复验证了lncRNA NEAT1通过mi R-448/GSDME途径调控辐射诱导肠细胞焦亡,为进一步治疗发展奠定了理论基础。辐射可以诱导人正常上皮细胞NCM460、人结肠癌细胞HT-29以及鼠正常肠上皮细胞MODE-K发生细胞焦亡。辐射诱导不同肠上皮细胞焦亡中Gasdermin蛋白家族成员的表达和激活情况不同。根据辐射诱导小鼠正常小肠上皮细胞焦亡的时间和剂量阈值,本文构建辐射诱导肠上皮细胞焦亡模型,测序分析显示囊泡转运、高尔基体蛋白转运相关通路基因参与辐射诱导的肠细胞焦亡调控。经验证Gsdme-N可以调控高尔基、囊泡相关基因表达。过表达Gsdme-N表达载体和使用蛋白质功能抑制剂处理后可以直接激活细胞焦亡出泡过程,说明辐射诱导激活Gsdme-N通过影响高尔基囊泡转运调控细胞焦亡出泡过程。