第一部分:Ckip-1负调控P.gingivalis刺激下成牙骨质细胞矿化目的研究酪蛋白激酶 2 相互作用蛋白-1(caseinkinase2interactingprotein-1,Ckip-1)在牙骨质形成、成牙骨质细胞矿化中的作用,进一步探究在P.gingivalis炎症环境下其对成牙骨质细胞矿化的调控作用。方法Micro-CT观察野生型(wild type,WT)、Ckip-1全敲(Ckip-1-/-)小鼠下颌第一磨牙牙骨质牙本质复合体和根管宽度,HE染色观察牙骨质厚度,免疫组化、组织免疫荧光染色检测成牙骨质细胞中Osterix表达;从矿化的小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30的转录组测序数据中筛选Ckip-1和矿化相关指标作热图分析;检测不同矿化天数、不同MOI Pg刺激的OCCM-30中矿化相关指标、Ckip-1和IL-6表达;评估过表达/敲低Ckip-1对OCCM-30矿化的作用;采用RT-qPCR、Western blotting、ALP染色、茜素红染色检测Pg、Pg-LPS刺激下OCCM-30矿化能力;检测sh-Ckip-1 OCCM-30的增殖能力及其在Pg、Pg-LPS刺激下的矿化能力;在上述情形下检测OCCM-30中多条信号通路变化;采用对应信号通路抑制剂,验证p38、Erk1/2、Akt信号通路在其中的作用。结果1.Ckip-1-/-小鼠下颌第一磨牙牙骨质-牙本质复合体增宽,根管腔缩小,有细胞牙骨NSC125066质增多,成牙骨质细胞中Osterix表达增高。2.Ckip-1在OCCM-30矿化过程中表达降低,在Pg刺激下表达升高。敲低Ckip-1可促进OCCM-30矿化、增殖,过表达Ckip-1抑制OCCM-30矿化。3.Pg、Pg-LPS可抑制OCCM-30矿化相关指标表达,抑制ALP活性和矿化结节形成能力。Pg或Pg-LPS刺激下,sh-Ckip-1 OCCM-30中矿化相关指标表达增加、ALP活性增加、矿化结节形成能力增强。4.敲低Ckip-1后,p38、Akt、Wnt信号通路被激活,Erk1/2信号通路被抑制;反之则反;抑制p38、Akt信号通路,Ckip-1敲低促进的矿化被削弱,抑制Erk1/2信号通路,Ckip-1敲低促进的矿化进一步增强。结论Ckip-1可负调控牙骨质形成和成牙骨质细胞矿化,Ckip-1敲低可通过MAPK、Akt信号通路促进成牙骨质细胞矿化、缓解Pg抑制的成牙骨质细胞矿化。第二部分:M2型巨噬细胞缓解P.gingivalis抑制的成牙骨质细胞矿化目的巨噬细胞是免疫炎性微环境中的重要细胞成员。本部分旨在研究M2型巨噬细胞对P.gingivalis刺激下成牙骨质细胞趋化、矿化的作用。方法采用IL-4诱导Raw264.7巨噬细胞M2极化并鉴定;采用结晶紫染色检测M2型巨噬细胞对Pg刺激的OCCM-30上清的趋化作用;RT-qPCR、Western blotting 和 ELISA 检测 Pg 刺激后 OCCM-30 中 CCL2 表达、释放;RT-qPCR 检测M2型巨噬细胞中CCR2表达;免疫组化检测根尖周炎(apical periodontitis,AP)小鼠成牙骨质细胞中CCL2表达;检测M2型巨噬细胞对CCL2培养基的趋化作用;采用条件培养基(conditional medium,CM)、Transwell共培养,在有或无Pg刺激下评估M2型巨噬细胞对OCCM-30矿化的影响;在上述条件下,检测p38信号通路变化;采用p38信号通路抑制剂,验证p38信号通路在其中的作用。结果1.IL-4诱导后巨噬细胞中M2极化相关指标表达升高,M1极化相关指标表达降低。M2型巨噬细胞趋化至Pg刺激的OCCM-30的能力更高。Pg刺激下OCCM-30表达、释放CCL2增加;体内炎medical subspecialties症状态下成牙骨质细胞中CCL2表达升高;M2型巨噬细胞中CCR2表达升高。M2型巨噬细胞趋化至含CCL2的培养基的能力更高。2.M2型巨噬细胞及其上清促进有/无Pg刺激下OCCM-30矿化相关指标表达。3.Pg刺激下M2型巨噬细胞上清、M2巨噬细胞可激活p38信号通路,抑制p38信号通路后矿化相关指标表达降低。结论Pg可诱发成牙骨质细胞释放CCL2,M2型巨噬细胞可通过CCL2/CCR2轴趋化至Pg刺激的成牙骨质细胞,并通过p38信号通路缓解Pg抑制的成牙骨质细胞矿化。第三部分:Ckip-1敲低诱导的M2型巨噬细胞促进成牙骨质细胞矿化目的Ckip-1可调控多种细胞功能并参与多种生物学过程。本部分旨在研究Ckip-1是否可调控Pg刺激下巨噬细胞M2极化进而促进成牙骨质细胞矿化。方法采用慢病毒感染构建Ckip-1稳转敲低的巨噬细胞(sh-Ckip-1)及其对照(sh-NC)并鉴定;Western blotting对sh-NC、sh-Ckip-1巨噬细胞中极化相关指标表达进行检测;采用LPS+IFN-γ、IL-4分别诱导sh-NC、sh-Ckip-1巨噬细胞M1、M2极化,RT-qPCR和Western blotting检测极化相关指标表达;采用Pg刺激普通巨噬细胞和sh-NC、sh-Ckip-1巨噬细胞,RT-qPCR和Western blotting检测极化相关指标表达;采用CM、transwell共培养评估sh-NC、sh-Ckip-1巨噬细胞对OCCM-30矿化的影响。结果1.绿色荧光提示转染效率可,sh-Ckip-1巨噬细胞中Ckip-1表达显著降低。Ckip-1敲低的巨噬细胞中CD206表达升高,IL-6表达降低。2.相较于对照组,M1极化刺激下sh-Ckip-1巨噬细胞中M1极化相关指标表达降低,M2极化刺激下sh-Ckip-1巨噬细胞中M2极化相关指标表达升高。3.Pg可诱导巨噬细胞M1极化相关指标表达升高,M2极化相关指标表达降低。相较于对照组,Pg刺激下sh-Ckip-1巨噬细胞中M1极化相关指标表达降低。4.sh-Ckip-1巨噬细胞上清、sh-Ckip-1巨噬细胞可促进OCCM-30矿化相关指标表达和ALP活性。结论Ckip-1敲低促进巨噬细胞M2极化,诱导Pg刺激下巨噬细胞由M1型向M2型转变。同时,Ckip-1敲低诱导的M2型巨噬细胞也可促进成牙骨质细胞矿化。第四部分:Ckip-1敲低诱导的M2型巨噬细胞来源外泌体递送Let-7f-5p缓解P.gingivalis抑制的成牙骨质细胞矿化目的M2型巨噬细胞是否可通过外泌体促进牙骨质再生尚未报道。本部分旨在研究Ckip-1敲低诱导的M2型巨噬细胞来源外泌体对Pg刺激下成牙骨质细胞矿化的影响及潜在机制。方法采用超速离心法提取M0、M2型巨噬细胞外泌体(M0-EXO、M2-EXO)和sh-NC、sh-Ckip-1 巨噬细胞外泌体(sh-NC-EXO、sh-Ckip-1-EXO),并对外泌体标志蛋白、外形、粒径进行鉴定;观察Dil标记的外泌体的内吞情况;采用各种外泌体刺激并selleckchem诱导OCCM-30矿化,RT-qPCR、Western blotting和ALP染色检测矿化能力;采用sh-NC-EXO或sh-Ckip-1-EXO诱导Pg刺激下OCCM-30矿化,同样对其矿化能力和IL-1β表达进行检测;RT-qPCR检测sh-NC、sh-Ckip-1巨噬细胞、sh-NC-EXO和sh-Ckip-1-EXO以及外泌体作用后OCCM-30中相关Let-7 miRNAs和si-Ckip-1表达;将瞬转FAM-Oligo的巨噬细胞与OCCM-30 transwell共培养,观察OCCM-30中是否有绿色荧光;从不同矿化天数OCCM-30的miRNA测序数据中筛选Let-7 miRNAs作热图分析;采用Let-7f-5p Mimic和Inhibitor评估其对OCCM-30矿化的影响。采用数据库预测Let-7f-5p的靶基因;检测Let-7f-Sp Mimic 和 Inhibitor、sh-Ckip-1-EXO 作用后 OCCM-30 中 Ckip-1 表达;双荧光素酶报告基因实验检测Let-7f-5p是否可靶向结合Ckip-1。结果1.巨噬细胞特征性标志物(F4/80、CD206)及外泌体标志物(TSG-101、CD63、HSP90)呈阳性,Calnexin呈阴性;外泌体呈杯状外形,平均粒径约140nm;观察可见各外泌体均可被OCCM-30内吞。2.M2-EXO、sh-Ckip-1-EXO均可促进OCCM-30矿化相关指标表达和ALP活性。sh-Ckip-1-EXO可缓解Pg抑制的OCCM-30矿化相关指标表达和ALP活性,以及Pg诱发的IL-1β表达。3.相较于各自对照,sh-Ckip-1巨噬细胞、sh-Ckip-1-EXO和sh-Ckip-1-EXO刺激后的OCCM-30中Let-7 miRNAs表达升高。巨噬细胞中转染的FAM-Oligo可转移至共培养的OCCM-30中。4.热图显示绝大多数Let-7 miRNAs随着OCCM-30矿化逐渐增加。Let-7f-5p Mimic促进OCCM-30矿化相关指标表达和ALP活性,Let-7f-5p Inhibitor抑制OCCM-30矿化相关指标表达和ALP活性。5.TargetScan、miRBase数据库预测并进一步验证Let-7f-5p可靶向结合Ckip-1。Let-7f-5p、sh-Ckip-1-EXO 可沉默 OCCM-30 中 Ckip-1 表达。结论sh-Ckip-1-EXO可通过递送Let-7f-5p至成牙骨质细胞靶向沉默Ckip-1,进而促进成牙骨质细胞矿化、缓解Pg抑制的成牙骨质细胞矿化。