结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染所引起的慢性传染病,据世界卫生组织估算,全球TB潜伏感染人群接近总人口的1/4;2022年,在30个TB高负担国家中我国估算TB发病数排第3位,初治和复治RFP耐药结核病(Rifampicin drug resistance tuberculosis,RRTB)患病率均高于全球平均水平。氟喹诺酮类(Fluoroquinolones,FQs)药物特别是莫西沙星(Moxifloxacin,Mox)和左氧氟沙星(Levofloxacin,Lfv)因其吸收快、组织透过性高等优点已广泛应用于RR-TBTelaglenastat体内和耐多药结核(Multi-drug resistance tuberculosis,MDR-TB)治疗,但Mtb对FQs药物的耐药性也随之不断增加,迫切需要强化耐药分子机制研究,以促进耐药性分子诊断产品研发与药物更新换代Trichostatin A试剂。尽管gyrA、gyrB基因突变是Mtb对FQs产生临床耐药性的主要原因,在临床FQs耐药株中占比60-90%,但仍有相当一部分FQs临床耐药株在这两个基因中没有发生突变,这表明Mtb中存在其他FQs耐药相关基因和机制,值得进一步研究。近期,有研究认为rv2005c、PPE59和rec C突变可能与Mtb FQs类药物耐药有关。为进一步验证、搜寻Mtb FQs耐药相关新基因,本研究从重庆市公共卫生医疗中心收集了217株临床准广泛耐药(Pre-extensively drug resistant,Pre-XDR)分离株,分析了gyrA、gyrB、rv2005c、PPE59和rec C基因中的突变情况;随后,在Mtb无毒株H37Ra和常用毒株H37Rv中构建了rv2005c基因敲除菌株和超量表达菌株,测试了rv2005c基因敲除和超量表达菌株对Mox和Lfv耐药性的影响;最后,收集gyrA、gyrB、rv2005c、PPE59和rec C基因中无突变的FQs耐药菌株,测定其全基因组序列。研究结果显示,在收集的217株Pre-XDR临床分离株中,215株在gyrA基因中发生突变,其中212株的突变发生于核心突变区,3株突变发生于非核心突变区。上述215株gyrA基因突变株中,有21株同时存在gyrB突变;2株同时存在rv2005c基因突变;未发现gyrB、rv2005c、PPE59、rec C基因突变单独存在的菌株。gyrA在氨基酸88、89、90、91、94和109位点存在突变,最常见的突变发生在gyrA D94G,占比71.89%(156/217),其次为gyrA A90G,占比11.98%(26/217),第三为gyrA D94N,占比9.69%(21/217);90、94位氨基酸最容易出现双突变,突变率均为4.61%(10/217)。gyrB基因突变当中,最常见的为gyrB D461N,占比4.60%(10/217)。rv2005c基因中发现的突变均为同义突变(P235P),占比0.92%。随后进行的药敏测试以及杀菌曲线结果显示,rv2005c基因敲除或超量表达均不影响Mox及LPathologic factorsfv的体外抗Mtb作用效果。以H37Rv为参照,对gyrA、gyrB、rv2005c、PPE59和rec C基因中均不存在突变的两株FQs耐药性临床分离株的全基因组序列进行了初步分析,共发现335处基因突变,包括多个已知耐药相关基因,如rpo B、kat G、emb B、pnc A。需以同期分离的敏感菌株为参照,结合国内外已有的FQs耐药菌株的全基因组序列信息,进行进一步分析。综上所述,本研究表明,重庆地区当前Mtb Pre-XDR临床分离株中普遍存在gyrA基因突变,显示其为FQs临床耐药性的主要原因;所发现的gyrB基因突变均伴随gyrA基因突变,显示前者并不适合单独作为Mtb FQs临床耐药性的分子标志;有少量分离株在所有测试的基因中的均未发生突变,表明Mtb的确存在其他的FQs耐药机制,但rv2005c基因与Mtb FQs耐药无关;通过对本研究收集的gyrA、gyrB、rv2005c、PPE59和rec C基因中均不存在突变的FQs耐药性临床分离株进行测序,结合国内外已有的FQs耐药菌株的全基因组测序数据扩大分析,有望找到新的FQs耐药相关基因。