脓毒症是可证实的或怀疑的感染诱发的失调的宿主反应引起致命性的器官功能障碍,严重时可以致残甚至死亡。近几十年的证据显示全世界脓毒症发病率居高不下,尤其是ICU人群。尽管伴随着近几十年的医学进步,对于脓毒症的理解逐步深入,治疗也取得了较大进步,但报道的死亡率仍高达40%。脓毒症心功能障碍(sepsis-induced cardiac dysfunction,SICD)是脓毒症常见的并发症,表现为与冠脉血管支配区不匹配的可逆的心脏收缩功能障碍和或舒张功能障碍。SICD的患者死亡率可增加2-3倍,文献报道为70-90%。SICD的确切发病机制目前仍不清楚,并且临床缺乏有效的治疗措施。研究认为失衡的炎症反应和氧化应激产生心肌抑制因子,诱发Ca~(2+)调节紊乱、β肾上腺素能失衡、线粒体功能障碍、能量代谢改变,以及这些改变又反过来加重炎症反应和氧化应激失衡等均参与了心肌抑制、损伤及部分坏死,导致心脏功能障碍,但基于这些机制的干预在临床研究显示出的治疗价值有限,仍需要进一步的研究来深入的理解其发病机制,发掘有效治疗,以改善患者的预后。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS),包括经典RAAS途径和非经典RAAS途径。两种途径在心脏的多种类型细胞均有表达。血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)是经典RAAS途径的主要效应分子,具有促炎效应,可以诱发心肌肥大、纤维化和心室重构,最终导致心功能障碍。血管紧张素1-7(angiotensin 1-7,Ang 1-7)是非经典RAAS途径的主要效应分子,具有与Ang点击此处 II相反的效应,因而具有抗炎和心脏保护作用。脓毒症时RAAS系统经典途径激活,Ang II显著增高,上调肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1(interleukin-1,IL-1),参与含pyrin域的NOD样受体家族蛋白3(nucleo-tide-binding domain,leucine-rich-repeat containing family,pyrin domain-containing 3,NLRP3)炎性小体激活,诱导白细胞浸润、微血管障碍和并参与脓毒症器官损伤包括心脏功能障碍。在脓毒症动物模型中,平衡RAAS系统可以控制过度的炎症反应,改善心功能和生存率。血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2),血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)的同源物,可以将具有促炎效应的Ang II裂解为具有抗炎效应的Ang 1-7,负向调节经典RAAS,对心脏有保护作用。重组人血管紧张素转换酶2(recombinant human ACE2,rh ACE2),已经被证实在炎性和非炎性心脏损伤模型中有心脏保护作用。而且出于安全的考虑,在rh ACE2对于急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)患者的临床试验中不仅显示出肺脏保护作用,还被证实对血流动力学没有抑制作用,可以被脓毒症ARDS患者和健康志愿者很好的耐受。NLRP3炎性小体,包含三个组成部分,分别是凋亡相关棘样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、NLRP3和天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)前体,是介导固有免疫反应的重要途径,研究显示NLRP3炎性小体激活参与了SICD发生发展。研究显示Ang II可以通过核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)激活NLRP3炎性小体。因此,本研究旨在观察SICD患者Ang II血浆水平与SICD发生的相关性和对脓毒症患者预后的影响。采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射的方法建立小鼠SICD模型,探讨SICD小鼠血浆Ang II的变化;应用rh ACE2调控SICD小鼠的血浆Ang II浓度,观察对炎症反应、心肌损伤和左心收缩功能的影响,并进一步探究调控Ang II对SICD小鼠心肌NLRP3小体激活及下游效应和相关分子信号途径的影响,为深入理解SICD的发病机制及和探寻新的治疗方向提供理论依据。第一部分脓毒症患者血管紧张素II水平与脓毒症心功能障碍的相关性分析目的:观察SICD患者、无心功能障碍的脓毒症患者及非脓毒症患者血浆Ang II水平的差异,探讨脓毒症患者Ang II血浆水平变化特点及其与SICD的相关性。方法:入选2022年2月至2023年2月沧州市中心医院三家ICU脓毒症患者,根据是否发生SICD,分为脓毒selleck症组和SICD组,选择同期入住ICU的非脓毒症非心衰脑卒中患者为对照组。收集入组患者的基线临床资料;测定患者入院后第一个清晨的血浆Ang II和炎症因子水平包括IL-1β和TNF-α。床旁超声心动图测定心功能指标包括LVEF、LVFS和E/A。采用独立样本t检验、行列卡方检验、单因素方差分析或非参数检验,Pearson或Spearman相关性分析,二元Logistic回归分析等对数据进行统计学分析。结果:1.研究期间连续入组符合脓毒症(sepsis 3.0)诊断标准的患者204例,排除不符合研究要求的患者,90例脓毒症患者纳入研究分析,其中54(60%)例未发生心功能障碍进入脓毒症组,36(40%)例发生心功能障碍进入SICD组。根据此研究排除标准随机筛选因脑卒中入住脑科院区EICU的非脓毒症非心衰患者20例作为对照。2.相比对照组,脓毒症组和SICD组患者均存在感染,PCT和WBC升高,APACHE II及SOFA评分更高,心率偏快,血压偏低,氧合指数偏低,乳酸和肾功能指标均偏高,ICU住院时间延长(P<0.05);相比对照组,脓毒症组和SICD组患者的Ang II、IL-1β和TNF-α血浆浓度明显升高(P<0.001)。3.脓毒症组和SICD组患者的感染病因分布、PCT、WBC、氧合指数、肾功能指标和ICU住院天数均无组间差异(P>0.05);相比脓毒症组,SICD组患者APACHE II及SOFA评分更高,血压更低,乳酸更高(P<0.001)。4.与脓毒症组相比,SICD组患者LVEF显著降低,BNP、c Tn I、CK-MB显著升,Ang II、IL-1β和TNF-α血浆浓度显著升高(P<0.001或P<0.05)。相关性分析显示Ang II与c Tn I、BNP和IL-1β均有一定程度的正相关(r_s=0.5198,P<0.001;r=0.579,P<0.001;r_s=0.562,P<0.001)。5.相比脓毒症组,SICD组患者28天病死率显著增高(P<0.05),APACHE II评分,BNP、Ang II和TNF-α血浆浓度,是否发生SICD均是脓毒症患者28天病死率的独立危险因素。小结:1.脓毒症患者Ang II水平显著高于非脓毒症患者。2.SICD患者的病情更重,ICU住院时间更长;SICD患者Ang II、IL-1β和TNF-α水平显著增高;脓毒症患者血浆Ang II水平与BNP和c Tn I、IL-1β水平呈一定程度的正相关。3.SICD患者28天病死率显著增高,APACHE II评分,BNP、Ang II和TNF-α血浆浓度,是否发生SICD均是脓毒症患者28天病死率的独立危险因素。第二部分脓毒症心功能障碍小鼠的血管紧张素II血浆水平变化目的:应用LPS腹腔注射的方法制备SICD小鼠模型,验证SICD小鼠Ang II的血浆水平变化。方法:对健康清洁级成年雄性C57BL/6N小鼠,采用LPS10mg/kg腹腔注射诱导SICD。在LPS腹腔注射后3小时、6小时对小鼠进行左心功能评估,记录LVEF和LVFS。接受等容量生理盐水腹腔注射的小鼠作为对照。在LPS或生理盐水注射后6小时复查心脏超声后给予小鼠安乐死,采血收集血浆用于检测c Tn I、TNF-α、IL-1β和Ang II浓度,取心脏组织制作石蜡切片进行HE染色观察心肌组织病理学改变并进行半定量评分。采用配对或独立样本t检验用于分析相关参数的变化或组间差异。结果:1.LPS 10mg/kg腹腔注射可以成功模拟脓毒症的临床表现,在LPS腹腔注射后3小时小鼠出现精神不振,少动和进食水减少,炸毛,对外界刺激反应减弱,呼吸、心率加快,寒战,眼睛流脓,腹泻等。2.LPS 10mg/kg腹腔注射3小时后小鼠LVEF及LVFS较LPS 0小时显著下降(P<0.0001),LPS 6小时LVEF及LVFS进一步下降。LPS组小鼠在LPS注射后3小时和LPS注射后6小时的LVEF及LVFS均显著低于对照组(P=0.001;P<0.0001)。3.SICD小鼠表现出明显的心肌损伤,血浆c Tn I和组织形态学损伤评分较对照组显著增高(P<0.0001)。4.SICD小鼠血浆Ang II、TNF-α和IL-1β较对照组均显著升高(P<0.0001)。小结:1.剂量为10mg/Kg的LPS腹腔注射可以成功制备SICD小鼠,SICD小鼠LVEF及LVFS显著下降和心肌损伤明显。2.SICD小鼠TNF-α、IL-1β和Ang II血浆水平显著升高。第三部分重组人血管紧张素转换酶2对脓毒症心功能障碍小鼠的血管紧张素血浆水平、炎症反应以及减轻心肌损伤和心功能的影响目的:采用腹腔注射的方法对SICD小鼠补充rh ACE2,观察rh ACE2对SICD小鼠心肌损伤和左室收缩功能以及血管紧张素水平的影响。方法:预实验阶段选用两组不同剂量(100ug/kg和200ug/kg)的rh ACE2对LPS诱导心功能障碍成功的Hepatocyte-specific genes小鼠进行干预,发现200ug/kg rh ACE2对SICD小鼠心功能有显著改善。正式实验阶段,选取C57BL/6N小鼠随机分为对照组、LPS组和LPS+rh ACE2组(每组6只),在LPS注射后3小时超声心脏评估完成后立即分别给予3组小鼠用生理盐水、生理盐水和200ug/kg rh ACE2干预。LPS注射后6小时完成超声检查并记录LVEF和LVFS后安乐处死小鼠取血浆及心肌组织。应用酶联免疫吸附的方法测定血浆c Tn I、Ang II、Ang 1-7、TNF-α和IL-1β浓度。心肌组织制作石蜡切片,进行HE染色观察组织形态学改变,并进行心肌损伤半定量评分。结果:1.预实验显示rh ACE2 200ug/kg可以改善SICD小鼠的脓毒症表现和心功能(P=0.002)。因此,选取rh ACE2 200ug/kg进行后续实验研究。2.与对照组小鼠相比,LPS组小鼠出现明显的脓毒症表现,LPS+rh ACE2组小鼠脓毒症表现较LPS组减轻。3.LPS组小鼠LVEF及LVFS较对照组显著下降(P<0.0001);而LPS+rh ACE2组小鼠LVEF及LVFS较LPS组显著改善(P=0.001)。4.LPS组小鼠血浆c Tn I较对照组显著增高(P=0.001),而LPS+rh ACE2组血浆c Tn I较LPS组明显减低(P=0.027);与对照组相比,LPS组小鼠心肌HE染色显示明显的组织形态学损伤,心肌损伤评分显著增加(P<0.0001),与LPS组相比,LPS+rh ACE2组小鼠心肌组织形态学损伤及心肌损伤评分明显改善(P=0.003)。5.LPS组小鼠血浆Ang II(P<0.0001)和Ang 1-7(P=0.001)较对照组均显著升高。LPS+rh ACE2组Ang II血浆水平较LPS组显著降低(P=0.001),LPS+rh ACE2组Ang 1-7血浆水平较LPS组进一步升高(P=0.007)。6.LPS组小鼠TNF-α和IL-1β血浆浓度较对照组显著增高(P<0.0001);LPS+rh ACE2组小鼠TNF-α(P=0.011)和IL-1β(P=0.038)血浆浓度较LPS组明显控制。小结:1.应用rh ACE2可以减轻SICD小鼠的心肌损伤,改善左心收缩功能。2.应用rh ACE2可以降低SICD小鼠的Ang II血浆水平,进一步提高Ang1-7血浆水平。3.应用rh ACE2可以降低SICD小鼠的TNF-α和IL-1β血浆水平。第四部分重组人血管紧张素转换酶2对脓毒症心功能障碍小鼠的心肌NLRP3炎性小体激活及相关炎症因子和心肌细胞焦亡的影响目的:使用rh ACE2对SICD小鼠模型进行干预,对小鼠心肌组织进行蛋白分子分析和组织病理学检查,观察rh ACE2对LPS诱导的心功能障碍小鼠心肌NLRP3炎性小体激活和细胞焦亡及促炎效应的影响,并探究其中可能的分子信号途径。方法:小鼠分组和干预与第三部分实验相同。血及心肌组织标本收集与保存方法与第三部分实验相同。应用ELISA方法检测血浆IL-1β和IL-18浓度;应用免疫印迹方法,检测心肌组织NLRP3蛋白表达水平和Caspase-1和GSDMD活化程度以及相关分子信号途径包括NF-κB,p38MAPK和AMPK-α1的激活情况;应用TUNEL染色方法,检测心肌细胞焦亡发生情况;采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较三组间各指标差异,组间两两比较采用Least significance difference(LSD)或Tamhane’s T2检验。采用Pearson相关性分析探讨心肌NLRP3蛋白表达水平与血浆Ang II浓度的相关性。结果:1.与对照组相比,LPS组心肌NLRP3蛋白表达、Caspase-1和GSDMD激活显著增高(P<0.0001);与LPS组相比,LPS+rh ACE2组心肌NLRP3蛋白表达(P=0.025)、Caspase-1(P=0.037)和GSDMD(P=0.006)激活明显受到抑制。2.与对照组相比,LPS组小鼠IL-1β和IL-18(两个依赖NLRP3炎性小体成熟的炎症因子)血浆水平显著增高(P<0.0001),而LPS+rh ACE2组小鼠IL-1β(P=0.038)和IL-18(P=0.011)血浆水平较LPS组显著下调。3.心肌组织切片TUNEL染色显示,LPS组小鼠心肌组织细胞焦亡比对照组显著增多(P<0.001);而LPS+rh ACE2组心肌组织细胞焦亡比LPS组明显控制(P=0.001)。4.相关性分析显示心肌NLRP3表达与血浆Ang II水平呈显著正相关(r=0.884,P<0.0001)。5.LPS组小鼠心肌组织内NF-κB,p38MAPK途径激活较对照组显著增强(P<0.0001),LPS+rh ACE2组小鼠心肌组织内NF-κB(P=0.033),p38MAPK(P=0.001)激活较LPS组显著抑制;与此相反,LPS组小鼠心肌组织内AMPK-α1途径激活较对照组显著减低(P<0.0001),而LPS+rh ACE2组小鼠心肌组织内AMPK-α1激活明显恢复(P=0.014)。小结:1.应用rh ACE2可以抑制SICD小鼠的心肌NLRP3炎性小体激活,降低NLRP3炎性小体相关炎症因子IL-1β和IL-18水平,降低心肌组织内细胞焦亡,而抑制NF-κB和p38 MAPK途径,增强AMPK-α1途径可能是其分子机制。2.NLRP3的心肌表达水平与Ang II的血浆浓度正相关,提示rh ACE2对NLRP3炎性小体激活的抑制效应,可能与其降低血清Ang II水平的作用相关。第五部分血管紧张素1-7受体阻断剂对重组人血管紧张素转换酶2在脓毒症心功能障碍小鼠中的心肌NLRP3表达的抑制效应和心脏保护作用的影响目的:应用Ang 1-7特异性Mas受体(Mas receptor,Mas R)阻断剂A779对接受rh ACE2治疗的SICD小鼠进行干预,观察A779对rh ACE2的SICD小鼠的心脏保护作用的影响,探究Ang 1-7血浆水平的变化是否参与了rh ACE2对SICD小鼠的心脏保护作用。方法:采用与第二、三部分相同的方法制备SICD小鼠模型。随机分为对照组、LPS组、LPS+rh ACE2组和LPS+rh ACE2+A779组(每组6只),LPS 3小时分别予生理盐水、生理盐水、rh ACE2及rh ACE2+A779干预。LPS 6小时行超声心动图检查后予安乐死,收集血浆及心肌组织。ELISA方法测定c Tn I血浆浓度,心肌组织石蜡切片进行HE和TUNEL染色,观察心肌损伤和心肌内细胞凋亡情况。应用免疫印迹方法测定心肌组织内NLRP3蛋白表达情况。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较三组间各指标差异,组间两两比较采用LSD(least significance difference,LSD)或Tamhane’s T2检验。结果1.LPS组小鼠LVEF及LVFS较对照组显著下降(P=0.003),LPS+rh ACE2组小鼠的LVEF和LVFS显著改善(P=0.016),而LPS+rh ACE2+A779组小鼠LVEF和LVFS较LPS+rh ACE2组明显变差(P=0.028)。2.LPS组小鼠的血浆c Tn I较对照组显著增高(P=0.002),心肌损伤评分较对照组显著严重(P<0.0001),LPS+rh ACE2组小鼠的血浆c Tn I(P=0.033)和心肌损伤评分(P=0.008)较LPS组显著改善,而LPS+rh ACE2+A779组小鼠的血浆c Tn I(P=0.04)和心肌组织形态学损伤以及损伤评分(P=0.015)较LPS+rh ACE2组明显恶化。3.LPS组小鼠心肌细胞焦亡较对照组显著增加(P<0.0001),LPS+rh-ACE2组小鼠心肌细胞焦亡较LPS组显著减少(P=0.021),而LPS+rh-ACE2+A779组小鼠心肌细胞焦亡较LPS+rh ACE2组小鼠显著增加(P=0.031)。4.LPS组小鼠心肌NLRP3表达较对照组显著增加(P<0.0001),LPS+rh ACE2组小鼠心肌NLRP3表达较LPS组小鼠显著下降(P=0.03),而LPS+rh ACE2+A779组小鼠的心肌NLRP3表达较LPS+rh ACE2组显著增加(P=0.04)。小结:Ang 1-7特异性Mas R阻断剂A779不仅可以减弱rh ACE2对SICD小鼠的NLRP3心肌表达和心肌细胞焦亡的抑制作用,还可以减弱rh ACE2对SICD小鼠的心肌损伤和心功能的改善作用,提示rh ACE2在SICD小鼠中的心脏保护作用可能与其增加Ang 1-7的效应有关。结论:1.SICD患者的c Tn I和BNP较脓毒症组显著增高,病情严重程度显著加重,ICU住院时间和28天死亡率显著增高;SICD患者Ang II、AIL-1β和TNF-α血浆浓度显著高于脓毒症无心功能障碍患者,并与脓毒症患者发生心功能障碍和28天病死率增加相关。2.予C57BL/6N小鼠LPS腹腔注射可以模拟临床脓毒症症并成功制备SICD模型。SICD小鼠LVEF和LVFS下降,心肌组织病理学显示心肌损伤,心肌损伤标志物升高,并且SICD小鼠炎症因子水平和血浆Ang II、Ang1-7水平均显著升高,与本研究第一部分在脓毒症患者中的观察结果一致。3.SICD小鼠心肌NLRP3炎性小体激活和心肌组织内细胞焦亡显著增加。应用rh ACE2可以降低SICD小鼠的炎症因子水平,减轻心肌损伤和心脏收缩功能障碍,其机制可能是通过抑制NF-κB和p38 MAPK途径,增强AMPK-α1途径,从而抑制了心肌NLRP3炎性小体激活和后续的炎症反应放大和心肌细胞焦亡,发挥了心脏保护作用。4.应用rh ACE2显著降低了SICD小鼠的Ang II血浆水平。相关性分析显示心肌NLRP3蛋白表达水平与血浆Ang II水平具有一定程度的正相关,提示rh ACE2对SICD小鼠心肌NLRP3抑制效应与其降低Ang II水平的效应有关。5.A779,Ang 1-7特异性Mas R阻断剂,不仅可以减弱rh ACE2对NLRP3心肌表达和细胞焦亡的抑制作用,还可以削弱rh ACE2对SICD小鼠的心肌损伤和收缩功能障碍的改善作用,提示rh ACE2在SICD中的心脏保护作用与其增加Ang 1-7的效应有关。因此,rh ACE2治疗可以降低SICD的血浆Ang II水平,升高血浆Ang1-7水平,通过对NF-κB、p38 MAPK信号途径的抑制和对AMPK-α1信号途径的增强,可以抑制心肌组织NLRP3炎性小体激活,具有抑制炎症反应和心肌细胞焦亡,改善心肌损伤和心脏收缩功能的作用。