到目前为止,脑卒中已经成为导致人类死亡和残疾的主要罪魁祸首,其中,占比为五分之三左右的缺血性脑卒中尤为严重。在中国,脑卒中的发病率和致死率首屈一指,其已成为我国医疗体系的一大沉重负担,然而对脑卒中的治疗目前仍然没有取得重大进展。因此,寻找脑卒中后神经元损伤的相关机制显得尤为重要。自噬是指自噬溶酶体系统降解细胞中受损的细胞器和异常的蛋白质的过程。越来越多的证据表明,脑缺血再灌注可激活脑内神经元、胶质细胞、脑微血管细胞等多种脑细胞的自噬。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)包括长链非编码RNA(longnon-coding RNA,lncRNA)和微小 RNA(microRNA,miRNA)等。到目前为止,大量研究发现,ncRNA虽然不具备编码蛋白质的能力,但是却能在各种疾病中发挥调控作用。近些年,对于lncRNA的研究比较火热,有大量研究发现lncRNA在缺血性脑卒中后的表达发生了明显变化,并且有相当多的lncRNA被证实在缺血性脑卒中疾病进程中发挥了重要作用。但是,到目前为止还存在大量的lncRNA尚未被研究,绝大部分lncRNA在缺血性脑卒中的机制亟待阐明。LncRNA和自噬均在脑缺血损伤中发挥重要作用,虽有研究发现脑缺血之后lncRNA与自噬之间存在密切关系,但lncRNA参与脑缺血后神经元自噬的调节机制还远未阐明,仍待进一步探索。因而本文旨在探究lncRNA通过自噬参与脑缺血再灌注损伤的机制。第一部分脑缺血再灌注后lncRNA NONRATT029757.2以及自噬蛋白表达的变化目的INCB28060作用:探寻lncRNA NONRATT029757.2以及自噬蛋白在脑缺血再灌注损伤中的变化。方法:1.随机将25只SD大鼠分为假手术(Sham)Surgical infection组、大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注 6 h 组、12 h 组、24 h组和48 h组(n=5),采用Longa评分对神经功能损伤程度进行评分;TTC染色测定脑梗死体积;Western blot检测各组脑缺血再灌注损伤侧脑组织中自噬蛋白LC3(微管相关蛋白1-轻链3,MAP1LC3)和Beclin 1表达水平;qRT-PCR对各组脑缺血再灌注损伤侧脑组织中lncRNANONRATT029757.2的表达进行定量分析。2.随机将SD大鼠皮层神经元和PC-12细胞系分为对照(Control)组、氧-葡萄糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)再灌注 6 h 组、12 h组、24 h组和48 h组(n=5),采用CCK法测定细胞活性;Hoechst-PI染色检测细胞坏死;Western blot检测各组OGD再灌注后自噬蛋白LC3、Beclin 1表达水平;qRT-PCR对各组OGD再灌注后lncRNANONRATT029757.2的表达进行定量分析。结果:1.Longa评分结果显示:与Sham组相比,缺血再灌注6 h组、12 h组、24 h组和48 h组均有不同程度的神经损伤症状表现,评分均在1-3分之间。2.TTC染色结果显示:与Sham组相比,缺血再灌注后脑组织发生了梗死,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.CCK结果和Hoechst-PI染色结果显示:与Control组相比,OGD再灌注后细胞活性明显降低,细胞坏死明显增多(P<0.05)。4.Western blot结果显示:自噬蛋白LC3和Beclin 1在MCAO和OGD再灌注后的表达存在动态变化。动物实验:与Sham组相比,MCAO再灌注6 h LC3和Beclin 1蛋白表达升高,但是差异无显著性,再灌注12hLC3和Beclin 1蛋白表达升高,再灌注24 h蛋白表达继续升高,差异均具有统计学意义(P<0.05),再灌注48hLC3蛋白仍维持在较高水平,差异有显著性(P<0.05),而Beclin 1蛋白表达下降,差异无统计学意义(P>0.05)。细胞实验:与Control组相比,PC12细胞系OGD再灌注12 h LC3和Beclin 1蛋白表达升高,再灌注24h蛋白表达继续升高,差异均具有统计学意义(P<0.05),再灌注48hLC3蛋白仍维持在较高水平,差异有显著性(P<0.05),而Beclin 1蛋白表达明显下降,差异无统计学意义(P>0.05)。5.qRT-PCR 结果显示:lncRNANONRATT029757.2 在 MCAO 和OGD再灌注后的表达存在动态变化。动物实验:与Sham组相比,MCAO再灌注6 h lncRNA NONRATT029757.2表达升高,但是差异无显著性,再灌注12 h lncRNANONRATT029757.2表达明显升高,差异有显著性(P<0.05),再灌注24 h lncRNA NONRATT029757.2表达维持在较高水平,差异具有统计学意义(P<0.05),再灌注48h表达下降,差异无统计学意义(P>0.05)。细胞实验:与Control组相比,原代神经元OGD再灌注6 h lncRNA NONRATT029757.2表达升高,再灌注12h继续升高,再灌注24h和48 h时有所下降,但仍维持在较高水平,差异均具有统计学意义(P<0.05);PC12 细胞系 OGD 再灌注 6hlncRNANONRATT029757.2 表达升高,但是差异无显著性(P>0.05),再灌注12 h lncRNA NONRATT029757.2表达升高,再灌注24h继续升高,再灌注48h下降,但仍维持在较高水平,差异均具有统计学意义(P<0.05)。第二部分LncRNA NONRATT029757.2通过上调自噬参与脑缺血再灌注损伤目的:在分子水平上验证lncRNA NONRATT029757.2可调控自噬蛋白的表达水平,影响OGD耐受。方法:1.以OGD再灌注损伤后实验的最佳干预时间点进行实验,将PC12细胞系随机分为Control组、OGD再灌注组、OGD再灌注+DMSO组和OGD再灌注+3-MA组(n=3)。其中,OGD再灌注+DMSO组和OGD再灌注+3-MA组提前一天在培养基中加入DMSO或3-MA试剂。采用Western blot检测各组自噬蛋白表达水平;CCK法测定细胞活性;Hoechst-PI染色检测细胞坏死。2.将PC-12细胞系随机分为Control组、OGD再灌注组、OGD再灌注+siRNA NC 组和 OGD 再灌注+lncRNA NONRATT029757.2 siRNA组(n=3)。其中,OGD再灌注+siRNANC组和OGD再灌注+lncRNA NONRATT029757.2 siRNA 组提前两天转染 siRNA NC 或siRNA。采用qRT-PCR检测siRNA转染效率,转染成功后构建OGD细胞模型,采用Western blot检测各组自噬蛋白表达水平;CCK法测定细胞活性;Hoechst-PI染色检测细胞坏死。结果:1.Western blot结果显示:与Control组比较,自噬蛋白在OGD再灌注组、OGD再灌注+DMSO组、OGD再灌注+siRNANC组表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与OGD再灌注+DMSO组比较,OGD再灌注+3-MA组自噬蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与OGD再灌注+siRNA NC组比较,OGD再灌注+lncRNANONRATT029757.2 siRNA组自噬蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.CCK和Hoechst-PI染色结果显示:与Control组相比,OGD再灌注组、OGD再灌注+DMSO组、OGD再灌注+siRNANC组细胞活性明显降低,细胞selleck LEE011坏死明显增多;与OGD再灌注+DMSO组比较,OGD再灌注+3-MA组细胞活性明显升高,细胞坏死明显减少;与OGD 再灌注+siRNA NC 组比较,OGD 再灌注+lncRNA NONRATT029757.2 siRNA组细胞活性明显升高,细胞坏死明显减少,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:LncRNA NONRATT029757.2可通过升高自噬水平参与脑缺血再灌注损伤