菌核是菌丝在不利环境下产生的菌丝聚集体。虎奶菇是一种能产菌核的高温食药用真菌,多生长于热带和亚热带地区,其菌核的有较高的营养和药用价值。现在对于虎奶菇菌核的研究多集中在关于其营养价值和生理活性成分的研究,而对于菌核形成的关注较少。目前已有研究发现非生物胁迫可以促进菌核的产生,如温度、营养条件、H_2O_2刺激等,且非生物胁迫可以激活生物体的酶促应答,由此猜想抗氧化酶参与了虎奶菇菌核形成的调控。因此,本文以抗氧化酶为切入点来探究非生物胁迫下虎奶菇菌核形成相关机制,以期为虎奶菇菌核增产提供参考,主要研究内容与结果如下:(1)探究了温度、pH、山梨醇、氮源限制、H_2O_2刺激五种非生物胁迫条件下的虎奶菇菌核形成和抗氧化酶活性的关系。发现25℃是虎奶菇菌核形成的关键温度,而在25℃培养下p H 8、2.5%和7.5%的山梨醇、3 mmol/L和4mmol/L H_2O_2刺激均能促进菌核形成,其中H_2O_2刺激的作用最明显,形成的菌核直径最大。在这些非生物胁迫条件下同步检测抗氧化酶活力,发现在对菌核形成有促进作用的胁迫条件下,往往抗氧化酶的综合活性也较高。(2)进行了虎奶菇25℃相对低温胁迫3 d前后菌丝的转录组学分析。一共检测R428 MW到264个差异表达基因,上调基因147个,下调基因117个,主要集中在碳水化合物代谢、氧化还原酶活性、催化活性和分子功能这四类。碳水化合物代谢中的差异表达基因几乎均为糖水解酶,且均为上调。氧化还原酶相关的差异表达基因中细胞色素P450酶系基因占比高达30%,且均为下调。推测在25℃相对低温胁迫初期,虎奶菇激活了碳水化合物代谢过程(尤其是糖水解酶)以及与跨膜运输相关蛋白,减弱了氧化酶活性(尤其是细胞色素P450酶系)以应对胁迫。(3)监测了25℃相对低温胁迫24 d中抗氧化酶和基因表达量的变化,发现SOD主要在胁迫的早期发挥作用,POD活性在胁迫的前中期较高,CAT则活跃在胁迫的中期。对五个抗氧化酶基因进行表达量分析发现POD.401和POD.535分别作用在胁迫的后期和中期,在菌核中分别表现为显著上调和下调。SOD.193的表达水平在胁迫初期较高,菌核中为2.8倍显著下调。CAT.1115和CAT.330均作用于胁迫中后期,但CAT.1115的作用持续时间较长且在菌核中的表达量为这几种抗氧化酶基因中的最高,认为CAT.1115与菌核形成的相关性较密切。(4)研究了过表达CAT.1115对虎奶菇胁迫耐受能力以及菌核形成影响。成功克隆虎奶菇的过氧化氢酶CAT.1115基因,构建出过表达载体点击此处p G-CAT。通过根癌农杆菌转化将质粒导入虎奶菇菌丝,经潮霉素抗性筛选、PCR验证、荧光显微镜检验证以及基因表达量验证得到pg CAT-1、pg CAT-2、pg CAT-3三个转化子,CAT.1115表达量分别为野生型菌株的1.6倍、2.8倍和3倍。发现转化子菌株在应对Students medical25℃相对低温以及H_2O_2刺激有更好的耐受力。在面对1 mmol/L H_2O_2的刺激下,过表达菌株在增加了CAT活性的同时也会促进SOD和POD的活性升高来共同抵御外界胁迫。在菌核形成验证中发现过表达CAT.1115抑制了虎奶菇菌核形成。推测抗氧化酶由于减弱氧化应激程度而抑制菌核形成。