骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种非常普遍的关节退行性疾病,常伴随多种病理改变,累及关节软骨、滑膜和关节周围肌肉等部位,患者在经历剧烈疼痛后最终丧失活动能力。据统计,全球超过3亿人患有OA,这一数字由于人口老龄化和肥胖等问题的日益严重而持续增长。然而,目前对于OA的临床治疗疗效非常有限,因此开发治疗OA的潜在药物势在必行。OA发病机制复杂,涉及机械、代谢、炎症反应等因素,其中软骨损伤导致软骨细胞外基质成分释放,进而激活补体系统,促进炎症因子释放并激活相关信号通路形成OA,在这一病程中,补体系统发挥了核心作用。硫酸软骨素(chondroitinsulfate,CS)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺组成的一类线性阴离子糖胺聚糖,根据其化学结构的差异,可分为CS-A、CS-E等不同种类型。研究表明CS可减轻OA患者的疼痛并延缓病程发展,已成为OA临床实践中的选择之一,其治疗OA的活性可能与补体系统相关,然而发挥疗效的功能单元、作用机制等尚未明确。本研究首先构建了购买PCI-32765 CS-E(海洋来源)寡糖的制备方法,筛选出了 CS-E二糖(ΔUA-diSE)是CS-E寡糖中具有最佳抗补体活性的最小功能单元,然后确证了其在补体系统中的主要靶点蛋白为C5。通过体外和体内实验,我们揭示了ΔUA-diSE在补体系统调节中的关键作用及发挥OA疗效的机制,包括ΔUA-diSE 与主要靶点 C5 相互作用的关系,以及通过靶向 C5 抑制膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC,也称 C5b-9)的形成,并相应地抑制 MAC 诱导的相关蛋白表达及下游MAPK与NF-κB等信号通路的激活;另外,通过构建C5基因敲除(C5-/-)小鼠模型进行相关活性与机制的研究,我们发现C5基因的缺失会使得炎症反应减弱,OA严重程度降低,同时使ΔUA-diSE的疗效下降,进一步确证了 C5在OA病程中的关键作用以及靶向C5在ΔUA-diSE发挥疗效过程中的核心位置。该部分研究通过鉴定ΔUA-diSE作为一种具有抗补体活性的补体抑制剂并探究其缓解OA的疗效与作用机制,不仅为OA治疗药物的开发提供了一种新的思路,也有可能为其他补体相关疾病提供一种有前景的C5靶向治疗方案。与其他CS相比,CS-E的硫酸化位点不同,制备步骤繁琐,分离难度更高。目前,临床上治疗OA多采用局部注射的给药方式,而ΔUA-diSE分子量低(Mr=605)且代谢速率较快,常规注射给药需要较大剂量,成本高昂,因此本研究对ΔUA-diSE的给药方式及剂型进ImmunoCAP inhibition行了初步探索以期延长其作用时间、降低使用成本、改善其疗效。目前,已有各种形式的具有长期活性的抗OA药物传递系统的报道,如脂质体、纳米颗粒、微粒等,虽然它们在一定程度上延长了释放时间,但仍存在一些不足,如靶向性、药物释放效率等还需更多的优化与改进。普朗尼克F127(Pluronic F127,PF127)是一种FDA批准的安全的温敏型生物材料,其在体温(37℃)下可由溶液转化为水凝胶,能够实现负载药物的原位缓释。此外,透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一类高度亲水的线性糖胺聚糖,自然存在于关节中,已被证明可以保持滑液润滑、促进软骨修复、改善关节功能。因此,本研究开发了一种新型的PF-HA-diSE水凝胶,将小分子ΔUA-diSE 加载到含有 HA 的 PF127 中,如同被储存在天然功能罐中。该水凝胶具有良好的成胶性质,可以通过与补体结合抑制C5b-9的形成,从而抑制其下游信号MMP13等因子的表达。体内实验表明,PF-HA-diSE水凝胶对DMM手术构建的OA有良好的治疗作用,缓解病变并降低关节部位C5b-9以及相关炎症蛋白的表达。同时,这项研究也首次报道了 PF127与补体成分之间的结合以及这种活性行为在OA治疗中的作用,除了作为一种温敏型缓释载体外,PF127的补体结合能力也值得重视和应用。本研究是PF-HA-diSE水凝胶复合体系在OA治疗中的初步应用和尝试,为进一步的研究提供参考,在骨组织工程方面具有广阔的应用前景。综上,本研究制备并筛选出了 CS-E寡糖中具有最佳抗补体活性的最小功能单元ΔUA-diSE,确证了其在补体系统的主要靶点蛋白C5,并探究了两者之间的相互作用;通过体内外实验进一步阐明了 ΔUA-diSE通过调节补体活性发挥OA疗效的机制;另外,开发了一种新型的PF-HA-diSE温敏型多功能水凝胶以改善ΔUA-diSE疗效。本研究为开发靶向补体系统的CS药物提供了新的思路与研究基础,有望克服目前OA临床实践中缺乏此网站有效治疗的瓶颈。