卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是一种致命的妇科恶性肿瘤,其中约70%的患者被诊断为晚期肿瘤。尽管癌症治疗已经取得了进展,但OC仍然是一种具有挑战性的疾病。目前,OC的治疗方式主要有手术治疗、化学治疗、靶向治疗和免疫治疗等,其中手术治疗结合化学治疗仍然是主要的治疗方式。相较于单一药物化疗,联合化疗治疗OC可提高疗效,降低耐药性,已广泛应用于临床。紫杉醇(Paclitaxel,PTX)和卡铂(Carboplatin,CBP)联合化疗是临床治疗OC的一线化疗方案。这两种药物在抑制OC生长中具有不同的机制,通过触发不同的细胞凋亡信号传导途径产生协同抗肿瘤作用。与所有化疗一样,PTX和CBP联合化疗也有严重的不良反应,如骨髓抑制、神经病变和肾毒性等。因此,临床上迫切需要一种治疗效果更好且不良反应更低的给药系统。脂质体、胶束、树状大分子、纳米胶囊和人工细胞等纳米载体能够通过增强通透性和滞留效应被动靶向肿瘤部位,已成为多年来的研究热点。在用于药物递送的纳米载体中,脂质体因为其无毒性,无免疫原性,对具有不同物理和化学性质的药物具有高负载能力,并且可进行表面修饰,以延长药物半衰期并实现药物的靶向递送,达到了安全且有效的治疗效果。除此之外,与正常细胞相比,OC细胞中雌激素受体(Estrogen receptor,ER)表达量更高,因此ER能够作为纳米颗粒向卵巢肿瘤递送药物的潜在靶标。雌酮(Estrone,ES)作为一种雌激素,可以特异性结合ER,并且对ER具有高亲和力。因此,本研究利用ES作为靶向片段,聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)作为长效片段,设计并制备了PTX和CBP共载长循环靶向脂质体(ES-PEG-Lip-PTX/CBP),对其各理化指标、体内外靶向性、药代动力学、抗OC效果及初步安全性等进行了系统性的研究工作。首先,建立了PTX和CBP的高效液相(HPLC)检测方法,该方法线性关系良好,专属性强,精密度和回收率均符合要求,结果准确可信。采用CCK-8法alignment media确定了PTX和CBP在摩尔比为1:1时具有最佳的协同效果。通过单因素实验结合正交实验,确定了采用薄膜水化法制备ES-PEG-Lip-PTX/CBP,其最佳处方和制备条件如下:磷胆比3:1、药脂比1:20、CBP浓度2.0 mg/m L、水化时间1 h。PEG的比例为5%时,脂质体的包封率略有升高,靶向片段的比例为0.5%时,脂质体具有较高的靶向能力。采用透射电子显微镜、马尔文粒径分析仪及HPLC对制备的ES-PEG-Lip-PTX/CBP进行表征,结果如下:ES-PEG-Lip-PTX/CBP呈均匀且分散的球形,粒径为105.4±0.2 nm,PDI为0.156±0.010,Zeta电位为-29.6±0.5 m V,PTX包封率为79.61±3.82%,CBP包封率为48.86±4.25%。稳定性考察结果证明了ES-PEG-Lip-PTX/CBP能够在4℃下稳定储存28天,并且48 h内渗漏率较低。ES-PEG-Lip-PTX/CBP在PBS介质中能够保持稳定,经过PEG的修饰,ES-PEG-Lip-PTX/CBP呈现出持续且缓慢的释放行为,无突释现象。采用荧光显微镜研究了体外细胞靶向及摄取机制,结果显示SKOV-3细胞对ES-PEG-Lip-PTX/CBP的摄取显著高于PTX/CBP共载长循环脂质体(PEG-Lip-PTX/CBP),说明ES靶向片段的修饰提高了脂质体的靶向能力,其摄取机制主要为ER受体介导的内吞,同时,ES-PEG-Lip-PTX/CBP也能通过巨胞饮作用和小窝蛋白介导的内吞作用进入细胞。血液相容性实验结果表明ES-PEG-Lip-PTX/CBP具有良好的血液相容性。体外细胞毒实验结果表明空白脂质体制剂对SKOV-3细胞没有细胞BMS-354825价格毒性,说明空白制剂具有较高的安全性。当装载了PTX和CBP后,ES-PEG-Lip-PTX/CBP呈现出最强的细胞毒性。SKOV-3细胞与ES-PEG-Lip-PTX/CBP孵育后,集落形成能力也受到了明显的抑制。同时,SKOV-3细胞经过ES-PEG-Lip-PTX/CBP处理后,细胞迁移能力显著下降,伤口闭合率明显低于PEG-Lip-PTX/CBP。除此之外,流式结果显示其诱导了更多的细胞发生凋亡,对SKOV-3细胞的杀伤能力显著高于PEG-Lip-PTX/CBP。细胞周期分析表明ES-PEG-Lip-PTX/CBP能够诱导更多的细胞停滞在G_2/M期,进而导致细胞凋亡。与对照组相比,ES-PEG-Lip-PTX/CBP还增加了SKOV-3细胞中促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)的表达,并下调了抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达。通过小动物活体成像技术证明了ES-PEG-Lip-PTX/CBP在SKOV-3裸鼠异种移植模型中展示出优异的肿瘤靶向性,与PEG-Lip-PTX/CBP相比,ES-PEG-Lip-PTX/CBP在肿瘤部位的荧光强度显著提高,通过对ER的特异性靶向实现了药物在肿瘤部位更多的富集。小鼠体内药代动力学结果表明由于PEG的修饰,ES-PEG-Lip-PTX/CBP在各个时间点下的血药浓度均有所升高,PTX和CBP的半衰期分别是普通脂质体的2.7倍和2.2倍,生物利用度得到了改善。在体内抗肿瘤作用研究中,ES-PEG-Lip-PTX/CBP对selleck Z-VAD-FMKSKOV-3荷瘤裸鼠肿瘤的治疗效果显著优于游离PTX/CBP,抑瘤率达到了81.83%,展示出了最强的抗肿瘤疗效,肿瘤组织病理学也显示出相同的结果,肿瘤细胞数量明显减少,肿瘤组织结构被破坏。初步安全性研究表明,经ES-PEG-Lip-PTX/CBP治疗后,裸鼠在整个抗肿瘤过程中体重没有出现下降,主要脏器的H&E染色结果无病理学改变,全血指标及肝肾的生化指标均与正常对照组无统计学差异,说明ES-PEG-Lip-PTX/CBP具有良好的安全性。除此之外,考察了单次静脉注射不同制剂对ICR小鼠的急性毒性,结果表明相较于游离PTX/CBP,ES-PEG-Lip-PTX/CBP显著提高了药物的半数致死剂量,最大程度降低了PTX/CBP的急性毒性。在SD大鼠中,通过多次静脉给予ES-PEG-Lip-PTX/CBP进行了初步长期毒性研究,结果证明了ES-PEG-Lip-PTX/CBP未引起大鼠的毒性反应,具有良好的安全性。综上所述,本文成功设计并制备了ES-PEG-Lip-PTX/CBP,通过表征研究证实了其具有良好的制剂特性,粒径、包封率、稳定性等均达到要求。体内和体外实验均证明了ES-PEG-Lip-PTX/CBP肿瘤靶向能力强,能够延长药物的循环时间,提高了PTX/CBP对OC的治疗效果,并且具有良好的安全性,是一种有潜力的OC治疗策略。