研究背景及目的骨折固定及假体植入已广泛应用于骨科植入物手术中,但因其无法抵抗微生物感染,而导致植入物相关感染的发生。我军海外基地、舰艇编队在执行远海作战任务时,大多数外伤伤部集中在四肢骨盆,伤员后送难度大,精确手术开展非常困难,由于远海作战伤员得不到及时有效的救治、后送困难,致残致死率高,严重影响作战和演训任务的顺利进行,并给伤员的伤后生活带来巨大的痛苦。对于四肢骨盆骨折,一期以外支架螺钉临时稳定骨折后修复软组织、二期更换髓内钉或锁定钢板的分Vorinostat浓度期治疗策略已被人们广泛接受。但外固定螺钉钉道感染和螺钉松动对二次手术转换时机以及外支架治疗的时限有很大影响。加上前线医疗条件差、设备简陋,战场恶劣环境也导致伤口极其易受感染。与骨科植入物相关的感染引起的过度炎症反应、进行性骨溶解和持续的细菌负荷,抑制了感染时的骨愈合。传统全身输注抗菌药物抗感染治疗可导致耐药性且副作用大,同时并不能抑制骨吸收和调节巨噬细胞炎症反应。为了改善细菌感染时的骨愈合,理想的治疗方法不仅要在局部清除细菌,还要促进骨修复、抑制炎症和骨溶解。因此,研制出一种具有抗感染、促进骨修复并抑制骨溶解和炎症的多功能生物材料,对骨科临床及我军一线战伤抗感染救治有重要的意义。近些年,通过对骨科植入物表面纳米结构改性或应用纳米载体来运送抗菌药物到给感染部位来增强局部抗菌效果越来越引起各国学者的关注。介孔二氧化硅纳米颗粒因其可控的孔径、高表面积、可调节的表面功能化、优良的化学稳定性和孔隙性质,成为生物医学等多领域的研究热点。本研究的目的是通过共价固定骨形态发生蛋白4的介孔二氧化硅纳米颗粒并负载依诺沙星来制备一种多功能纳米载药颗粒,具有良好的生物相容性和缓释药物的功能,用于局部抗菌、抑制炎症和骨溶解。同时,通过体内、外实验验证骨形态发生蛋白4/依诺沙星修饰介孔二氧化硅纳米颗粒的抗菌性能、抑制炎症和骨溶解能力。研究方法利用ABT-199溶胶-凝胶法制备介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs),并在氨化的介孔二氧化硅纳米颗粒表面共价接枝骨形态发生蛋白4(BMP4)以及在介孔二氧化硅纳米颗粒孔隙中负载依诺沙星(EN)。随后应用扫描电子显微镜(SEM)以及透射电子显微镜(TEM)观察涂层表面结构。所有样品通过超声分散在无水乙醇中后,使用纳米粒度分析仪测量纳米颗粒的分散性。通过药物释放实验研究介孔二氧化硅/骨形态发生蛋白4/依诺沙星纳米颗粒(MSNs-BMP4-EN)药物释放能力。通过体外抑菌实验测定MSNs-BMP4-EN纳米颗粒最低抑菌浓度(MIC)并记录其对金黄色葡萄球菌的生长曲线,并利用细菌活性实验、细菌涂板定量实验和活/死细菌染色实验来评估MSNs-BMP4-EN的体外抗菌性能。通过体外细胞毒性实验(CCK-8法)来探究纳米颗粒对大鼠骨髓间充质干细胞(r BMSCs)增殖的影响。通过碱性磷酸酶(ALP)染色及定量实验、胶原染色及定量实验、茜素红(ARS)染色及定量实验以及大鼠的成骨分化标志物基因RNA定量分析、蛋白质印迹分析,研究MSNs-BMP4-EN对r BMSCs成骨分化的影响。利用抗酒石酸磷酸酶(TRAP)染色、破骨相关标志物基因RNdrug-resistant tuberculosis infectionA定量分析和骨吸收实验,评估MSNs-BMP4-EN对破骨分化的影响。利用Sanger测序、酶联免疫吸附试验(ELISA)炎症相关标志物基因RNA定量分析,评估MSNs-BMP4-EN对感染状态下局部炎症免疫的影响。通过构建大鼠股骨骨缺损模型,进行体内抗感染实验及体内成骨实验,利用micro-CT分析、微生物学分析、组织切片和Van Gieson染色等多种实验方法评估MSNs-BMP4-EN在体内的抗感染、成骨能力。研究结果利用SEM和TEM对纳米颗粒进行了分析,证实了成功合成了所需的MSNsBMP4-EN纳米复合材料,其呈粒径约50 nm的均匀球形、表面有许多均匀分布的孔洞。粒径分析仪显示三种纳米粒子在无水乙醇中分别形成直径分别为210.7 nm、220.7 nm和187.4 nm的粒子团。依诺沙星在吸光度286nm处有一个特征峰,浓度与吸光度呈良好的线性关系。其包封率和载药量分别为43.25%和30.10%。药物释放实验显示MSNs-BMP4-EN纳米颗粒具有较高的药物释放率,在12小时内爆发释放依诺沙星后可持续缓释5天。在第5天时依诺沙星的累积释放率为67.4%。体外抑菌实验证实,MSNs-BMP4-EN可显著抑制金黄色葡萄球菌的黏附和增殖。体外细胞毒性实验和成骨分化相关实验表明,MSNs-BMP4-EN可促进r BMSCs增殖及早期、晚期成骨分化。体外破骨分化相关实验表明,MSNs-BMP4-EN可阻止早期破骨细胞的形成、抑制骨溶解。体外炎症相关实验表明,MSNs-BMP4-EN可抑制小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)分泌炎症因子,从而改变免疫微环境,有利于成骨分化和细胞外基质矿化。动物体内实验表明,MSNs-BMP4-EN可有效抑制金黄色葡萄球菌感染并抑制感染时的巨噬细胞炎症反应和细菌导致的骨溶解,最终促进骨感染条件下的骨愈合。研究结论MSNs-BMP4-EN纳米复合材料具有制备方法简单、成本低、高载药量、较久的缓释性能及良好的生物相容性等优点。这些实验表明MSNs-BMP4-EN具有优良的抗菌和抗炎特性,并能在植入物感染的早期阶段抑制骨吸收,从而进一步促进骨愈合。因此,这种具有多种生物功能的纳米复合材料在治疗骨感染方面具有良好的临床应用前景,未来有望转化为临床骨科植入物涂层或手术部位植入药物,并对我军一线战伤抗感染救治有重要的意义。