研究背景:高氯酸盐可由人为源,例如军事和工业产生,或是由大气化学反应产生释放至环境当中,通过自然迁移富集至食物链,进而暴露于人群,对人类健康产生影响。高氯酸根具有和碘离子相似的结构,可以与碘离子竞争性结合钠-碘同向转运体(NIS),导致促甲状腺素和甲状腺激素水平紊乱,对人体甲状腺功能产生影响。多项研究表明高氯酸盐具有甲状腺毒性,并基于下丘脑-垂体-甲状腺(HPT)轴研究了高氯酸盐对于甲状腺激素稳态、甲状腺激素相关作用靶点的影响以及健康风险评价。有关高氯酸盐对其他非甲状腺结局通路有害健康效应的研究非常有限,且未考虑到环境中高氯酸盐暴露至人体内的真实水平,这在一定程度上增加了高氯酸盐食品安全风险评估中的不确定性。本课题以人肝癌细胞HepG2细胞系为研究对象,在人群高氯酸盐膳食暴露水平的基础上基于能量代谢相关代谢通路及脂质代谢通路研究了高氯酸盐的毒性作用。研究方法:(1)根据第六次膳食调查结果,参考高氯酸盐膳食暴露水平第99百分位值(1.48μg/kg),本研究采用同等水平下1.5μg/kg的高氯酸钠标准溶液作为低剂量组,并依据一定安全系数,选取六个不同剂量浓度(0μg/kg、1.5μg/kg、15μg/kg、150μg/kg、1500μg/kg、15000μg/kg)的高氯酸钠标准溶液对HepG2细胞进行24小时毒性作用,采用MTT检测方法测试细胞活性的变化。确立膳食暴露水平的100倍及10000倍分别为高氯酸盐中剂量(150μg/kg)和高剂量(15000μg/kg)暴露组,并对1.5μg/kg、150μg/kg及15000μg/kg浓度高氯酸钠标准溶液下暴露24小时的HepG2细胞进行油红O染色实验,基础生化指标测定以及分析检测细胞内葡萄糖水平。(2)基于非靶向代谢组学方法,对HepG2细胞在1.5μg/kg、150μg/kg及15000μg/kg浓度的高氯酸钠标准溶液下暴露24小时后相关能量代谢物的变化进行分析检测,采用多元统计分析方法筛选高氯酸钠各暴露组的潜在差异代谢物。对筛选出的差异代谢物进行鉴定并进行通路富集分析。(3)建立针对脂代谢相关差异代谢物表达量的非靶向和靶向检测方法,对HepG2细胞在1.5μg/kg、150μg/kg及15000μg/kg浓度的高氯酸钠标准溶液下暴露24小时后脂质代谢物的变化进行检测分析,并进行通路富集分析。(4)综合代谢组学及脂质组学技术分析的结果,筛选出HepG2细胞在1.5μg/kg、150μg/kg及15000μg/kg浓度高氯酸钠标准溶液下暴露24小时后,导致能量代谢及脂质代谢紊乱的相关生物标志物。结果:(1)采用MTT法对1.5μg/kg、150μg/kg和15000μg/kg高氯酸盐剂量下HepG2细胞的毒性进行检测,结果表明膳食暴露水平高氯酸盐作用下,细胞活性有所升高,当以高氯酸盐中、高剂量浓度干预细胞时,细胞活性显著性下降,并呈现剂量效应。油红O染色实验发现高氯酸盐对于HepG2细胞内脂滴的形成有着显著的影响。对细胞内基础性生化指标检测的结果显示SB431542使用方法,总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平较对照组呈上升趋势,其中TG变化genetic prediction水平具有显著性(p<0.05)。与对照组相比,高氯酸盐干预组细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量显著性下降,丙二醛(MDA)含量升高,结果表明细胞受到脂质氧化损伤的影响,抗氧化能力显著下降。细胞内葡萄糖(GLU)水平在高氯酸盐作用后显著下降。实验结果表明,高氯酸盐可导致HepG2细胞脂质代谢与能量代谢紊乱。(2)利用MS-DIAL 4.70和SIMCA P14.1软件对非靶向代谢组学质谱信息进行数据可视化处理和多元统计分析。在研究剂量下,初步筛选出26个差异代谢物。将26个潜在差异代谢物通过Metaboanalyst在线平台进行通路富集分析,结果表明,高氯酸盐通过丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,精氨酸与脯氨酸代谢,精氨酸生物合成,三羧酸循环(TCA循环),D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢五条代谢途径对HepG2细胞能量代谢产生影响,并确立了6种生物标志物,分别是:天冬氨酸、精氨酸、柠檬酸、苹果酸、谷氨酸和瓜氨酸。(3)对脂质组非靶向监测结果进行数据可视化处理及多元统计分析,结果发现,在VIP值>1,P值<0.05,FC值>1.2或<0.8条件下初步筛选并鉴定出73个脂质差异代谢物,其中三个剂量组内均发生显著性改变的化合物有以下14个:Cer(d18:1/24:1),Cer(d18:1/25:0),PG(16:0/18:1),PC(16:0/16:0),PI(16:1/16:1),PI(18:2/18:2),PC(18:1/22:6),Stearoyl-EA,Lyso PC(20:1/0:0),Lyso PC(22:1/0:0),PE(14:0/18:1),PE(16:1/18:1),PE(16:1/22:6)和PC(16:0/22:5)。将73个潜在差异代谢物进行通路富集分析,结果表明,高氯酸盐通过甘油磷脂代谢途径和鞘脂代谢途径对HepG2细胞脂质代谢产生影响,并确立了42个生物标志物,主要包括磷脂类、溶血磷脂类、鞘脂类和神经酰胺四类代谢物。采用靶向脂质组学检测方法对以下10种化合物进行定量分析:Cer(d18:1/24:1)、Cer(d18:1/25:0)、Lyso PC(20:1/0:0)、Lyso PC(22:1/0:0)、PE(14:0/18:1)、PE(16:1/18:1)、PE(16:1/22:6)、PC(16:0/22:5)、PC(18:1/22:6)和PC(16:0/16:0),结果表明与非靶向监测的趋势一致,说明非靶向脂质组学的结论可信。结论:本研究采用高氯酸盐膳食暴露剂量为低剂量组,膳食暴露水平的100倍及10000倍分别为高氯酸盐中剂量和高剂量暴露组。高氯酸盐主要通过三羧酸循环等代谢通路对HepG2细胞能量代谢产生影响,共筛查并鉴定出了6种生物标志物,分别是:天冬氨酸、精氨酸、柠檬酸、苹果酸、谷氨酸和瓜氨酸。高氯酸盐对于HepG2细胞脂质代谢的影响主要是通过甘油磷脂代谢通路和鞘脂代谢通路产生,共筛查并鉴定出42个生物标Pevonedistat作用志物,主要为磷脂类、溶血磷脂类、鞘脂类和神经酰胺。