肠道炎症是危害猫健康的主要病理性损伤之一,多种因素均可以诱发该损伤。目前在临床中该病的发生呈现上升趋势。黄连素是提取自中药黄连中的一种单体成份,对于腹泻具有良好的治疗作用。近期有研究显示多种中药及其单体成分可以通过调控肠道菌群保护肠道组织细胞。本研究以猫结肠炎症为主要研究对象,分析黄连素是否可以有效治疗猫肠道炎症,并通过分析该药物对肠道菌群的调控,肠道炎症损伤及收缩功能的调节作用,从而揭示黄连素的作用机制,期望为临床猫肠道炎症疾病的治疗开发新的宠物用药。本试验采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导建立急性结肠炎模型,模拟结肠炎的临床症状。选用健康成年短毛猫12只(雄雌各半,体重2.0-2.3kg),随机分为三组:正常对照组(CON)、DSS诱导结肠炎组(DSS)和黄连素治疗组(DSS+BBR)。记录猫体重、结肠长度,采用宏基因组分析技术,对肠内容物进行菌群丰度分析和组成差异分析,并通过病理组织学分析、实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹分析等技术,检测炎症反应、细胞死亡、肠道紧密连接及肠道平滑肌收缩相关调控分子基因及蛋白,验证黄连素对于结肠炎的保护作用,探究肠道菌群在黄连素对结肠炎的治疗机制中的作用。结果如下:(1)临床症状、疾病活动指数评分和结肠组织病理学变化检测DSS诱导的猫结肠炎体重变化、结肠长度、疾病活动指数、组织病理学切片以评估黄连素(BBR)的影响。结果表明,BBR对于DSS诱导的猫结肠炎具有保护作用,能显著缓解体重损失和结肠缩短的症状,降低疾病活动指数,结肠H&E染色病理学切片可见,对照组结肠粘膜上皮细胞形态正常且无炎性细胞的浸润,而DSS组结肠切片中可见大量的炎性细胞浸润,BBR组的结肠切片中炎症明显减轻,整个切片细胞结构与对照组相似。(2)肠道菌群结构与功能的变化DSS造模成功后,猫的粪便菌群组成发生了极大的变化,BBR重塑了肠道微生物群,厚壁菌门增加,拟杆菌门下降,二者比例增加。物种累积曲线显示证明采集的粪便样品量足够进行本试验的物种组成分析。通过物种组成分析各组间物种组成,从试验结果中可以看出BBR导致普雷沃氏菌的增加,DSS诱导结肠炎中变形菌的丰富度降低。相对丰度分析和Beta多样性分析比较了各组样本间的多样性,PCo A与PCA分析均可看出BBR猫的组间重复性较好,即它们的粪便菌Belnacasan分子式种组成相似性较高,而DSS与之相比,猫粪便中菌种组成紊乱。对肠道微生物群落进行物种聚类热图分析和随机森林分析显示经过黄连素治疗之后Brain Delivery and Biodistribution有害菌和有益菌之间的平衡得到恢复,并且代谢通路差异性分析显示新陈代谢相关通路的丰度最高。综合结果显示,BBR对于肠道菌群具有调节作用,可以维持肠道微生物稳态。(3)结肠组织炎症相关调控信号分子分析结果炎症相关基因结果表明,DSS组显著升高了猫结肠中Caspase-1,IL-1β,NLRP3,ASC,JAK2,STAT3表达(p<0.05)。研究结果表明BBR通过调控JAK2/STAT3信号通路,并激活炎症小体NLRP3,导致炎性因子表达降低(p<0.05),从而对猫结肠炎症起到保护作用。(4)结肠组织细胞死亡相关分子分析结果检测结果显示,与CON组相比,DSS组Bax,Caspase-3,Caspase-7和Caspase-12基因的蛋白和m RNA表达增加,Bcl-2基因表达下降(p<0.05),同时,DSS组p-MLKL/MLKL,p-RIP1/RIP1和p-RIP3/RIP3蛋白表达水平升高(p<0.05),而BBR成功抑制上述基因的表达,说明DSS可引起结肠组织细胞凋亡现象加剧,程序性坏死的表达升高,即DSS引起结肠组织细胞死亡增加的结果,而BBR可以减轻上述结果。(5)结肠组织中紧密连接相关基因分析结果检测发现DSS组N-Cadherin,E-Cadherin,Slug,ZO-1,ZEB的m RNA和蛋白表达显著降低(p<0.05),与DSS组相比,DSS+BBR组m RNA和蛋白水平都显著增加,说明DSS影响结肠内紧密连接基因的表达,结肠上皮细胞紧密连接减弱,BBR可一定程度的恢复DSS诱导的结肠紧密连接的损伤。(6)结肠组织中平滑肌相关基因分析结果检测发现DSS组中的Ca~(2+)浓度明显升高,CaM的表达也相应增高,磷酸化MLC表达被激活,平滑肌收缩曲线加强,Ca M,MLCK,Rock,Rho A,m RNA和蛋白表达显著升高(p<0.05),而经过BBR治疗之后这些情况都得到显著缓解,逐渐接近正常水平。说明DSS引起结肠平滑肌发生损伤,平滑肌收缩现象明显,BBR治疗之后结肠内的平滑肌收缩现象得到显著缓解。综上所述,本研究证实黄连素可以有效保护猫结肠组织,缓解炎症损伤。黄连素可以调节肠道菌群结构,提高有益菌的比例,降低有害菌的比例;进一步调控JAK/STATs信号降低炎性小体的水平抑制炎症发生;同时调控细胞凋亡及程序性坏死关键JNJ-42756493配制信号分子,阻止细胞死亡,保持组织结构完整;调控平滑肌收缩,维持猫结肠组织功能稳定。黄连素通过调节肠道菌群从多个方面对猫结肠炎症发挥保护及治疗作用,为进一步将其开发应用于宠物肠道疾病的临床治疗提供了帮助。