【目的】糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,容易诱发糖尿病微血管并发症(Diabetic microvascular complications,DMVC),其中糖尿病肾脏病(Diabetic kidney disease,DKD)和糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)为最常见和严重。天然黄酮类化合物灯盏乙素(Scutellarin,SCU)、木犀草素(Luteolin,LTD)等具有较好的心血管保护作用,课题组前期研究发现黄酮类化合物SCU、LTD及其新衍生物LTD2明显改善祖克DM肥胖大鼠血管微循环病变,但需要深入揭示其分子机制。此外,文献及我们前期研究表明,miRNA在调节DR进展中起着重要作用,挖掘对DR发生、发展具有诊断和预测价值的miRNA生物标志物,对DR早期筛查具有重要意义。本研究采用db/db小鼠建立DMVC动物模型,探讨天然黄酮类化合物SCU/LTD及其衍生物LTD2对DKD、DR的保护作用及分子机制,为天然黄酮类化合物SCU/LTD及其衍生物LTD2在DMVC中的临床应用提供科学实验依据。此外,通过临床DM患者的标本研究,发现DR早期筛查相关的miRNA生物标志物,提高早期筛查准确度。【方法】1.受试化合物改善db/db小鼠肾脏病变及其分子机制模型建立、给药处理方法:饲养正常小鼠及2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)模型db/db小鼠至16周,分为正常(Normal)组、模型(Model)组、二甲双胍(Metformin,Met)组(200mg/kg/d),SCU组(45mg/kg/d)、LTD组(45mg/kg/d)、LTD2组(45mg/kg/d)、Met(200mg/kg/d)+SCU(45mg/kg/d)组、Met(200mg/kg/d)+LTD(45mg/kg/d)组及Met(200mg/kg/d)+LTD2(45mg/kg/d)组,联合用药的目的是观察药物的协同作用和治疗效果。检测评价指标:1)给药期间监测空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)、尿白蛋白(Urine albumin,UALB)、尿白蛋白肌酐比值(Urine albumin creatinmedia literacy interventionine ratio,UACR);给药结束后处死小鼠,留血清检测小鼠空腹胰岛素、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(Serum creatine,SCr)、糖化血红蛋白(Glycosylate hemoglobin type A1C,Hb A1c)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)等指标,并对肾脏组织进行病理形态学检测,评价受试化合物对DKD的保护作用。2)采用Bio-Plex悬液芯片技术检测血清炎症因子白介素6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)水平;ELISA检测血清内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)水平。3)采用肾组织行转录组学检测分析并实验验证,探讨受试化合物拮抗DKD潜在分子机制。4)分别使用Western Blotting和免疫荧光检测db/db小鼠肾组织腺苷一磷酸活化蛋白激酶a(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPKa)、p-AMPKa(Thr172)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、p-mTOR(Ser2448)、内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric-oxide synthase,eNOS)、p-eNOS(ser1177)的蛋白表达及其磷酸化水平。5)观察受试化合物对差异基因Arhgef10l、Ckb、Muc4及Pvalb的调控作用,采用qRT-PCR检测db/db小鼠肾组织差异基因Arhgef10l、Ckb、Muc4及Pvalb的表达水平。2.受试化合物改善db/db小鼠视网膜病变及其分子机制模型建立、给药处理方法:饲养正常小鼠及T2DM模型db/db小鼠至16周,分为Normal组、Model组、Met组(200mg/kg/d),SCU组、LTD组、LTD2组均为45mg/kg/d。检测评价指标:1)给药期间监测FBG、体重;给药结束时行视网膜电图(Electroretinogram,ERG)、光学相干断层扫描(Optical coherence tomography,OCT)、荧光素眼底血管造影术(Fundus fluorescein angiography,FFA)、视网膜血管消化铺片检查;给药结束后处死小鼠,留血清检测小鼠肝功(丙氨酶氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶)、BUN、SCr、TC、TG,评价受试化合物对DR的保护作用。2)采用视网膜组织行转录组学分析,探索受试药拮抗DR潜在机制。3)观察受试化合物对差异基因Nrn1、Slc17a6、Esrrb及Nos3的调控作用,使用qRT-PCR检测db/db小鼠视网膜组织Nrn1、Slc17a6、Esrrb、Nos3基因的表达水平。3.针对临床标本研究糖尿病视网膜病变早期筛查miRNA生物标志物采用生信分析方法,从基因表达综合数据库(Gene expression omnibus,GEO)下载DR和新生血管(Neovascularization,NEO)的miRNA和m RNA数据集。差异基因分析后,使用miRNet和miRWalk构建miRNA-m RNA网络。在Metscape中进行富集分析。结合Gene Cards筛选的29个基因构建蛋白质互作用网络(Protein-protein interaction networks,PPI network),并利用Cytoscape计算中心基因。TransmiR用于预测转录因子(Transcription factors,TCX-5461配制F),Drug Bank用于预测靶向药物的TF。收集58例T2DM患者的全血和临床资料,采用qRT-PCR、logistic和受试者工作曲线特征(Receiver operating characteristic curve,ROC)方法验证关键miRNA。【结果】1.受试化合物改善db/db小鼠肾脏病变及其分子机制1.1受试化合物改善db/db小鼠肾脏病变的药理作用与Normal组比较,Model组FBG、UALB、UACR、SCr、BUN明显升高,而空腹胰岛素水平降低。与Model组相比,受试化合物可降低FBG水平,改善空腹胰岛素水平及降低UALB、UACR、SCr、BUN水平,证明受试化合物对DKD有明显保护作用。与阳性药Met组比较,各实验组在干预治疗后无统计学差异。此外,Met+LTD2组FBG降低显著,Met+SCU组和Met+LTD2组UALB降低显著。1.2受试化合物降低db/db小鼠血清炎症细胞因子水平与Normal组比较,Model组血清ET-1水平显著升高。与Model组比较,受试药可降低血清ET-1水平,特别是Met组和Met+SCU组。与阳性药Met组比较,各实验组在干预治疗后无统计学差异。1.3转录组学分析受试化合物拮抗DN潜在分子机制db/db小鼠肾脏组织转录组学分析发现:可见SCU该化合物的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGS)富集在肾脏、血管、视觉系统发育这些重要通路上,LTD该化合物的DEGS参与肾小管的发育、形成,为他们参与减轻DM的肾脏损伤的分子机制做出了提示。1.4受试化合物调控db/db小鼠肾组织eNOS及AMPK/mTOR信号通路与Normal组比较,Model组AMPKa、p-AMPKa(Thr172)、eNOS和p-eNOS(Ser1177)的蛋白表达水平下调,而mTOR和p-mTOR的蛋白表达水平上调。与Model组比较,受试化合物上调了db/db小鼠肾组织AMPKa、p-AMPKa(Thr172)、eNOS和p-eNOS(Ser1177)的蛋白表达水平,下调了mTOR和p-mTOR的蛋白表达水平。与阳性药Met组比较,各实验组在干预治疗后无统计学差异。1.5受试化合物对差异基因的调控与Normal比较,Model组基因Arhgef10l和Muc4下调显著,Ckb基因上调,而Pvalb基因上调显著。与Model组比较,受试化合物上调基因Arhgef10l和Muc4。与阳性药Met组比较,各实验组在干预治疗后无统计学差异。2.受试化合物改善db/db小鼠视网膜病变及其分子机制2.1受试化合物改善db/db小鼠视网膜病变的药理作用与Normal组比较,Model组FBG、体重、TC和TG水平显著升高,BUN和Cr水平升高,与Model组比较,受试化合物显著降低TG、BUN、Cr水平。与阳性药Met组比较,各实验组在干预治疗后无统计学差异。与Normal组相比,Model组糖尿病db/db小鼠视网膜ERG的a波振幅显著下降、b波潜伏期明显延长,视网膜血管瘤数量显著增加,视网膜毛细血管网的内皮细胞增生及周细胞凋亡。与CP-690550Model组比较,而受试化合物可以逆转上述改变,减少视网膜微血管瘤的数量,减轻视网膜毛细血管网的内皮细胞增生及周细胞凋亡。与阳性药Met组比较,各实验组在干预治疗后无统计学差异。实验证明,受试化合物对小鼠DR具有明显保护作用。2.2转录组学分析受试化合物拮抗DR的潜在分子机制糖尿病db/db小鼠视网膜组织转录组学分析发现:可见SCU该化合物的DEGS表达富集在眼睛的发育上;由于血管是循环系统的重要组成部分,DEGS可能参与了整体循环系统的关键一环。LTD2该化合物的DEGS参与血管生成的调节,这与DR中血管发生的损伤过程密切相关,提示LTD2治疗具备靶向糖尿病视网膜损伤的潜力可能。2.3受试化合物调控db/db小鼠视网膜组织差异基因的表达与Normal组比较,Model组基因Nrn1、Slc17a6、Esrrb、Nos3上调。与Model组比较,受试化合物下调基因Nos3和显著下调基因Nrn1。3.针对临床标本研究糖尿病早期筛查miRNA生物标志物差异分析表明存在共同调节DR和NEO的基因和miRNA。富集分析显示,关键基因与新生血管密不可分。PPI结合中心基因结果鉴定出4个候选miRNAs,分别为hsa-mir-4328、hsa-mir-4422、hsa-mir-548z和hsa-mir-628-5p。qRT-PCR、logistic和ROC结果显示,这些miRNAs的表达随着DR的发生和进展而下调,同时,降低的水平预示着T2DM患者发生DR的风险。【结论】1.天然黄酮类化合物SCU/LTD及其衍生物LTD2明显改善db/db小鼠的FBG水平和空腹胰岛素水平,降低UALB、UACR、Cr、BUN水平,对DN具有保护作用,其机制与抑制血清ET-1的水平;上调肾组织eNOS蛋白表达水平,激活AMPK、抑制mTOR蛋白表达水平相关;可能通过调控差异基因Arhgef10l、Ckb、Muc4和Pvalb表达来保护肾脏。受试化合物与二甲双胍联合用药对db/db小鼠的肾脏保护作用比单一用药更优。2.天然黄酮类化合物SCU/LTD及其衍生物LTD2通过改善db/db小鼠a波振幅,b波潜伏期,减少视网膜微血管瘤数量,对DR具有保护作用;受试化合物拮抗DR作用可能通过调控差异基因Nrn1、Slc17a6、Esrrb、Nos3的表达来保护视网膜,延缓DR进展有关。3.通过DM患者临床标本研究表明,全血中hsa-mir-(4328,4422,548z和-628-5p)是DR的保护因子,可作为诊断和预测的新型生物标志物。