瘢痕疙瘩是一种纤维增生性疾病,通常由烧伤、创伤或感染后伤口的异常愈合导致,其特征是成纤维细胞增殖增加以及细胞外基质过度沉积。患者临床表现常有瘙痒、疼痛和外观畸形,严重者可伴有出血、溃疡和感染,极度影响患者的生活质量。瘢痕疙瘩表现出许多肿瘤性的特征,包括不受控制的侵袭性生长、高复发率以及与肿瘤相似的生物能量学。基于5-氨基乙酰丙酸的光动力疗法(5-ALA-PDT)是一种已经用于临床治疗瘢痕疙瘩的有效治疗方法,其原理主要通过产生活性氧物质(ROS)来介导细胞毒性作用。铁死亡是一种新型的细胞死亡模式,以致命的铁依赖性脂质过氧化为特征,受到多种细胞代谢过程的调节,包括氧化还原稳态、铁代谢、线粒体活VX-661体内性、氨基酸代谢等。在脂质过氧化和铁死亡过程中,ROS也是一个关键因素。本课题以人正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织以及从中提取的成纤维细胞为研究对象,主要探讨了5-ALA-PDT是否能诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞发生铁死亡,以及其中可能涉及的潜在机制。这为进一步理解PDT治疗下瘢痕疙瘩成纤维细胞中的氧化应激状态和细胞死亡过程奠定了基础,也为临床上通过铁死亡途径促进5-ALA-PDT对瘢痕疙瘩的治疗效果提供了新的思路。一、5-ALA-PDT对瘢痕疙瘩成纤维细胞的效应及最佳实验参数的筛选:1.对离体组织和原代细胞的鉴定:HE染色显示,相较于正常皮肤,瘢痕疙瘩真皮层中粗大的胶原纤维较多,排列复杂紧密,细胞数量较高。波形蛋白免疫组化染色结果显示,提取的原代细胞波形蛋白阳性,实验中所提取、培养的原代细胞为较高纯度的成纤维细胞。2.5-ALA-PDT对瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞毒性作用:CCK-8结果显示,在5-ALA浓度0-8mM和光照强度0-80 J/cm~2的范围内,5-ALA-PDT对瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞活力抑制呈5-ALA浓度和光照强度依赖性,且在8mM和80 J/cm~2达到最大。3.5-ALA在瘢痕疙瘩成纤维细胞中转化为PpIX:通过荧光显微镜观察,随着5-ALA浓度的增加,荧光显微镜下的PpIX荧光强度随之增强。4.5-ALA-PDT在瘢痕疙瘩成纤维细胞中诱导ROS的产生:在相同能量密度的光照下,4mM组的ROS荧光强度明显高于1mM组;在同样的5-ALA浓度下,ROS荧光强度呈光照强度依赖性,且在32J/cm~2达到最高。5-ALA-PDT诱导产生RBYL719体内实验剂量OS的趋势与铁死亡诱导剂Erastin诱导产生ROS的趋势相似。二、5-ALA-PDT诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞铁死亡:1.5-ALA-PDT处理后瘢痕疙瘩成纤维细胞中的差异性表达基因:mRNA测序分析显示5-ALA-PDT处理后瘢痕疙瘩成纤维细胞中显著上调的基因包括PTGS2和ATF3,提示可能涉及铁死亡。2.Western Blot结果显示,相较于正常皮肤成纤维细胞,细胞周期蛋白CCND1和铁死亡相关蛋白GPX4、xCT在瘢痕疙瘩成纤维细胞中高表达,5-ALA-PDT可抑制该趋势。3.5-ALA-PDT诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞的铁死亡:通过试剂盒检测发现5-ALA-PDT可升高瘢痕疙瘩成纤维细胞内Fe~(2+)、脂质过氧化物、丙二醛的水平,其趋势与铁死亡诱导剂Erastin相似;而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1的预处理可以逆转5-ALA-PDT的该趋势。透射电镜下观察相较于对照组,5-ALA-PDT和Erastin处理组瘢痕疙瘩成纤维细胞内线粒体呈现铁死亡的特征性改变,即线粒体固缩,体积变小,线粒体膜及基质密度增大,线粒体嵴减少。4.Western Blot结果显示,5-ALA-PDT对瘢痕疙瘩成纤维细胞高表达CCND1、GPX4、xCT的抑制作用与Erastin处理后的趋势相似,且Ferrostatin-1的预处理可以逆转5-ALA-PDT的该趋势。综上所述,我们发现5-ALA-PDT导致瘢痕疙瘩成纤维细胞中ROStibio-talar offset和脂质过氧化水平升高,并伴有抗铁死亡蛋白xCT和GPX4下调。这些结果表明,5-ALA-PDT可能通过增加ROS,同时抑制xCT和GPX4,从而促进脂质过氧化并诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞发生铁死亡。