熊果酸(UA)是天然三萜羧酸化合物,存在于plant-food bioactive compounds各种水果、蔬菜和草药中,具有很好的预防和抗癌活性。阿霉素(DOX)是临床Galunisertib抑制剂上使用的一种广谱抗肿瘤药物,可抑制RNA和DNA的合成,属周期非特异性药物。UA不仅能够诱导凋亡癌细胞,还能提高多种肿瘤细胞对DOX药物的敏感性,并有效抑制肿瘤组织的生长,降低肿瘤细胞的转移能力且对正常细胞几乎没有副作用。虽然UA在治疗癌症方面有很大的前景和优势,但是其水溶性差,生物利用率低;而DOX对正常细胞有较强副作用,造成心肌损伤和心力衰竭,且两种药物缺均乏靶向性,从而限制了临床应用。铁蛋白通过24个亚基组装形成球形笼状结构,广泛存在于动植物和微生物中。人重链铁蛋白(HFtn)具有水溶性好、生物相容性佳、稳定性好、粒径均一等优点。除此之外大多数肿瘤细胞表面能过表达转铁蛋白受体1(Tf R1),铁蛋白能够与其特异性结合,并在该受体的介导下有效进入细胞,从而达到主动靶向。本研究将疏水性的UA和亲水性的DOX药物共包封进铁蛋白内腔,构建铁蛋白-阿霉素/熊果酸纳米药物(HFtn-DOX/UA),以提高UA的水溶性,减少DOX的毒副作用,并对该纳米粒子的靶向性、抗肿瘤效果进行评价。研究结果如下:(1)成功表达出人重链铁蛋白(HFtn),并通过镍柱和FPLC等纯化过程获得目的蛋白。通过体积排阻色谱(SEC)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)等方法验证,成功表达并纯化出目的蛋白。(2)利用热处理法,即在60℃孵育4 h,将疏水的UA和亲水的DOX药物成功包封进铁蛋白纳米笼内,制备了HFtn-DOX/UA纳米药物。最优纳米粒中每个铁蛋白内腔可包封90个UA和18个DOX药物。DOX和UA的装载并没有影响蛋白载体的聚合状态(24聚体)、二级结构(α-螺旋)以及形态特征(球形笼状结构)。体外药物释放结果表明,HFtn-DOX/UA纳米药物在生理p H 7.4条件下相对稳定,48 h的药物释放量低于20%;而在溶酶体p H 5.0条件下,UA和DOX的释放量明显增加,48 h的药物释放量高达75%,该结果表明HFtn-DOX/UA纳米药物的释放具有p H依赖性。(3)对所制备的HFtn-DOX/UA纳米药物进行体外抗肿瘤活性评价。体外细胞毒性结果显示,游离的药物与HFtn-DOX、HFtn-UA以及HFtn-DOX/UA纳米药物均对MCF-7和A549细胞表现出抑制作用,且均呈现浓度增加抑制率增强。在相同浓度下,HFtn-DOX/UA纳米药物对MCF-7和A549细胞的抑制率最高,双载药的抑制率明显高于单载药。通过药物联合指数分析(CI)证明DOX与UA药物确实具有协同作用,且药物负载比例为1:5时协同作用最强。Calcein AM/PI活死细胞染色实验进一步证明了制备的HFtn-DOX/UA纳米药物对MCF-7和A549细胞的毒性作用最强。细胞划痕实验证明HFtn-DOX/UA纳米药物可以有效抑LEE011 IC50制MCF-7和A549细胞的迁移能力。细胞凋亡结果显示HFtn-DOX/UA纳米药物诱导细胞凋亡的能力最强。通过构建MCF-7细胞的3D肿瘤球评估构建的纳米药物抑制肿瘤生长效果,结果表明HFtn-DOX/UA纳米药物抑制肿瘤球生长能力最强,双载药的抑制能力高于单载药,由铁蛋白递送药物对肿瘤球的抑制效果更好。以上结果均表明HFtn-DOX/UA纳米药物是一种很有前景的药物递送系统,为同时负载亲水和疏水药物提供借鉴。