目的:口腔癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤。自噬是一种保守的涉及溶酶体降解细胞的分解代谢方式,通过清除受损的大分子物质及细胞器和再生代谢前体物质来维持细胞的活性。研究报道microRNA与自噬在癌症发生发展过程中起着重要的调控作用。在我们前期研究中发现miR-181a-5p在口腔癌发病过程中起着重要的作用,目前有关于miR-181a-5p和自噬在口腔癌中发病的作用机制研究未见报道。因此,本研究通过细胞水平和动物水平探讨miR-181a-5p对口腔癌自噬的影响及潜在机制。方法:1.合成过表达miR-181a-5p载体并通过慢病毒转染获得稳定过表达miR-181a-5p的CAL27细胞系(LV-miR-181a-5p),转染空载体为阴性对照组(LV-NC),CAL27细胞系为空白对照组(Control)。使用嘌呤霉素筛选稳定转染的LV-miR-181a-5p及LV-NC细胞株,分别采用激光共聚焦显微镜和qRT-PCR检测转染效率;细胞爬片后进行HE染色检测miR-181a-5p对CAL27细胞形态结构的影响;使用CCK-8实验和克隆形成实验检测miR-181a-5p对CAL27细胞增殖的影响;采用细胞划痕实验及Transwell侵袭迁移实验检测miR-181a-5p对CAL27迁移和侵袭的影响。2.利用miRTar Base、Target Scan、ENCORI和miRDB等生物信息学数据库筛选miR-181a-5p的靶基因;采用Metascape软件对关键靶基因进行通路富集分析,绘制通路富集结果气泡图;使用双荧光素酶报告基因验证miR-181a-5p与BCL2的靶向关系;利用qRT-PCR和Western Blot检测细胞中BCL2的基因和蛋白表达;通过String在线平台和KEGG数据库预测BCL2和Beclin1的互作关系。3.以LV-NC细胞株作阴性对照,CAL27细胞系作为空白对照,采用qRT-PCR和Western Blot检测不同组别细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin1、ATG5和ATG7的基因和蛋白的表达,利用透射电镜观察细胞中的自噬小体形成情况。4.以LV-NC组作阴性对照,LV-miR-181a-5p组为实验组构建裸鼠成瘤模型,在动物水平检测miR-181a-5p对口腔癌细胞自噬的影响。利用qRT-PCR检测肿瘤组织中miR-181a-5p的表达。通过HE染色观察瘤体病理学变化。采用qRT-PCR、Western Blot和免疫组织化学染色(IHC)检测肿瘤组织中自噬相关LC3Ⅱ、p62、BCL2、Beclin1、ATG5和ATG7的mRNA及蛋白表达水平。结果:1.通过qRT-PCR检测显示LV-miR-181a-5p细胞的miR-181a-5p的表达量是LV-NC和CAL27的2.8倍左右,表明利用慢病毒成功构建过表达miR-181a-5p的稳转株。相比较于Control细胞和LV-NC细胞,LV-miR-181a-5p细胞的增殖能力、集落形成、迁移和侵袭能力都普遍降低。2.应用4种生物信息学软件预测miR-181a-5p的靶基因,发现BCL2是所有预测软件的交集基因。此外,靶向预测发现其3′UTR区存在多个与miR-181a-5p种子序列的结合位点,提示BCL2很可能是miR-181a-5p的直接靶基因。双荧光素酶报告基因实验进一步证实miR-181a-5p与BCL2具有直接靶向关系;qRT-PCR和Western Blot检测发现miR-181a-5p下调BCL2 mRNA和蛋白表达。Protein-Protein Interaction(PPI)互作网络显示BCL2和Beclin1存在相互作用购买AMG510关系。3.通过qRT-PCR和Western Blot检测发现LV-miR-181a-5p细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ、ATG5、ATG7和Beclin1的mRNA和蛋白表达明显高于LV-NC细胞,p62 mRNA和蛋白的表达显著低于LV-NC细胞。透射电镜下观察,LV-Bioactive metabolitesmiR-181a-5p细胞中的自噬小体和自噬囊泡数量显著高于LV-NC细胞。4.通过裸鼠成瘤实验发现LV-miR-181a-5p组裸鼠皮下成瘤能力显著低于LV-NC组,与LV-NC组相比,LV-miR-181a-5p组中LC3Ⅱ、Beclin1、ATG5和ATG7的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而p62的表达显著降低(P<0.05),与细胞水平的结果一致,表明BAY 73-4506LV-miR-181a-5p组自噬能力增强。结论:本研究通过慢病毒转染成功构建稳定过表达miR-181a-5p的CAL27细胞株,发现miR-181a-5p可促进口腔癌细胞CAL27发生自噬,证实miR-181a-5p与BCL2具有靶向关系,体内外实验表明过表达miR-181a-5p对自噬相关基因具有调控作用。这些结果提示miR-181a-5p可能通过靶向BCL2调节口腔癌细胞自噬的发生,为口腔癌的治疗提供新的靶点和思路。