乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,对女性健康构成极大威胁。现代医学已经发展出多种有效的治疗手段,如手术、放疗、化疗以及生物治疗等。阿霉素(Adriamycin,简称为ADR,又被称作多柔比星Doxorubicin,简写为Dox)是乳腺癌治疗中常用的化疗药物之一,但耐药性的出现显著限制了其临床应用。因此,深入了解乳腺癌的耐药机制,寻找新的治疗靶点,提高乳腺癌的治疗效果具有重要的临床价值。本研究采用药理工具药和基因干预技术,以耐阿霉素的MCF-7/ADR细胞为模型,系统地研究了FABP5在乳腺癌对阿霉素耐药中的作用及机制,为改善乳腺癌的治疗提供新的治疗靶点和策略。第一部分MCF-7/ADR细胞耐药属性鉴定目的:收集MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞,观察两种细胞的差异,并对MCF-7/ADR细胞的耐药属性进行鉴定。方法:1.细胞耐药属性鉴定:采用光学及电子显微镜观察MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞(简称ADR细胞)的形态,分别用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)检测Dox对两种细胞的抑制率,结果用半抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC_(50))值来表示,采用计算法求出MCF-7/ADR细胞对阿霉素的耐药指数。运用Western Blot(WB)技术检测两种细胞耐药相关蛋白、多药耐药相关蛋白(Multi-drug resistant associate protein,MRP1)和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-GP)的表达水平,采用激光共聚焦显微镜观察细胞内药物的积累量。2.ADR细胞和MCF-7细胞的糖脂水平差异:运用透射电子显微镜观察细胞的超细微结构,分别采用糖原周期性酸-希夫(Periodic Acid-Schiff stain,PAS)染色法和油红O染色法观察两种细胞的糖原含量及脂滴情况。结果:1.ADR细胞确为耐药细胞:MCF-7和ADR细胞存在形态差异。MCF-7细胞呈椭圆形,形状均匀;ADR细胞呈多边形,大小不一。Dox对MCF-7细胞及ADR细胞作用的IC_(50)分别是4.5μM和213sport and exercise medicine.2μM,ADR细胞的耐药指数为47.4。WB结果显示,相较于MCF-7细胞,ADR细胞MRP1和P-GP呈高水平表达(P<0.05)。同时显微镜观察到,给予相同剂量5μM的Dox 24 h,相较于MCF-7细胞,ADR细胞内药物积累较少(P<0.05)。2.ADR细胞和MCF-7细胞的糖脂水平差异:透射电子显微镜观察发现,MCF-7细胞存在大量糖原,ADR细胞内含量甚微。PAS法染色进一步证实MCF-7细胞存在大量糖原,而油红O染色法发现ADR细胞内存在大量脂滴。小结:1.ADR细胞确实是MCF-7细胞的耐阿霉素细胞株。2.MCF-7细胞和ADR细胞存在糖脂差异。第二部分ADR细胞的耐药机制初步分析目的:比较MCF-7及ADR细胞FABP5、钙/钙调蛋白依赖激酶II(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase typeⅡ,Ca MKII)、活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)和细胞内钙离子浓度的差异,为其机制分析打下基础。方法:1.MCF-7细胞和ADR细胞FABP家族的表达差异:运用q RT-PCR技术和生物信息学技术,分析MCF-7细胞和ADR细胞FABPs和Ca MKIIs的表达,筛选出表达差异大的目标m RNA分子进行WB实验。通过免疫组化技术检测耐药乳腺癌患者和敏感乳LY294002研究购买腺癌患者的组织中FABP5和p-Ca MKII的表达情况。2.MCF-7细胞和ADR细胞脂质过氧化的差异:运用流式细胞术检测给予铁抑素-1(Ferrostatin-1,Fer-1)前后细胞内ROS水平、细胞内钙离子浓度、线粒体膜电位及脂质过氧化水平的变化情况。WB实验检测细胞间的谷胱甘肽过氧化酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)的蛋白表达情况。3.细胞内钙浓度对ADR细胞存活力的影响:运用CCK-8技术,检测BAPTA-AM和Dox联合应用对ADR细胞的存活率,并和给药前相比较。结果:1.q RT-PCR和基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库的结果显示,与MCF-7细胞相比,ADR细胞的FABP5和Ca MKII高表达,且均具有显著性差异(P<0.05)。WB实验进一步证实FABP5和Ca MKII在ADR细胞中高表达(P<0.05)。临床乳腺癌患者的组织样本免疫组化结果显示,和敏感患者相比,耐药患者FABP5和p-Ca MKII的表达显著增加。2.流式细胞术的结果显示,与MCF-7细胞相比,ADR细胞ROS及细胞内钙离子浓度较高(P<0.05)。JC-1染色结果显示,两种细胞的红色荧光没有显著性差异,ADR细胞绿色荧光弱于MCF-7细胞,即ADR细胞的线粒体膜电位高于MCF-7细胞。WB实验结果显示,与MCF-7细胞相比,ADR细胞内的GPXCP-456773半抑制浓度4表达较少(P<0.05)。给予Fer-1后,ADR细胞的ROS含量、线粒体膜电位及细胞膜脂质过氧化均没有显著性差异,即铁死亡不影响ADR细胞的线粒体膜电位,且与ADR细胞的耐药无关。3.CCK-8结果显示,相较于单独给予Dox,BAPTA-AM和Dox联合应用后,ADR细胞的存活率降低,ADR细胞对阿霉素的耐药性降低(P<0.05)。小结:ADR细胞内的FABP5、Ca MKII、ROS和细胞内钙离子浓度均高于MCF-7细胞,提示其可能与耐药性存在联系。第三部分FABP5调节ADR细胞耐阿霉素的作用机制目的:采用si RNA技术敲低ADR细胞的FABP5表达,探讨其与阿霉素耐药性的关系和其可能的作用机制。方法:1.FABP5低表达后细胞的改变:采用si RNA技术敲低ADR细胞的FABP5表达,通过q RT-PCR和WB技术验证si FBAP5的敲低效果,运用CCK-8技术检测ADR细胞的IC_(50)值,采用克隆形成实验观察细胞增殖和耐药情况,采用流式细胞术检测细胞内钙离子浓度和ROS的变化,通过WB技术检测PPARγ、p-Ca MKII、LC3Ⅱ/Ⅰ和P62等蛋白的变化。采用同样的方法,观察SBFI-26(FABP5的抑制剂)对ADR细胞的影响。2.Dox与不同蛋白的结合力分析:运用分子对接技术,对P-GP和FABP5和Dox的结合力进行分析。结果:1.q RT-PCR和WB结果显示,与si NC相比,siFABP5确实降低了FABP5的表达。FABP5被抑制后,ADR细胞的药物敏感性急剧上升,IC_(50)值从304.5μM下降到187.3μM。菌落形成实验显示,与单独使用Dox相比,抑制FABP5表达和Dox组,ADR细胞的集落形成能力大幅降低。另外,siFABP5后,细胞中钙的积累明显减少。与si NC组相比,siFABP5会使PPARγ、p-Ca MKII的表达急剧下降,用SBFI-26也观察到类似的结果。与si NC相比,siFABP5减少了LC3II/Ⅰ,但P62没有差异。与单独使用Dox相比,SBFI-26和Dox的联合应用增加了LC3II/Ⅰ和P62。另外,流式结果发现,与对照组相比,siFABP5并没有减少ROS的水平,但是,SBFI-26组却有不同的结果。2.分子对接结果显示,Dox与FABP5(对接分数从-6.00到-8.78千卡/摩尔)的结合能量大于与P-GP(对接分数从-1.47到-3.01千卡/摩尔)。小结:1.siFABP5可以降低ADR细胞对Dox的耐药性,这一作用可能和其减少PPARγ、p-Ca MKII的表达,减少自噬有关。2.FABP5和Dox的结合力比P-GP的结合力更强。结论:FABP5可以调节ADR细胞对Dox的耐药性,这一作用可能和其减少PPARγ和p-Ca MKII的表达、减少自噬及细胞内钙蓄积有关。该研究结果为临床乳腺癌的预防和治疗策略提供了新的治疗靶点。