目的:我国肥胖和代谢综合征患病率增长迅速,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为我国第一大慢性肝病,也是健康体检中肝脏生化指标异常的首要原因。NAFLD的疾病特点是在没有过量饮酒或其他明确的损肝因素的情况下,肝脏脂质沉积过多,发生脂肪变性,其发生机制为肝细胞中脂质稳态的失调诱导有毒脂质的产生,引起细胞器功能失调,导致包括细胞凋亡、坏死或焦亡等在内的细胞死亡。肝脏脂毒性细胞死亡是NAFLD疾病发生发展的关PacBio and ONT键,现定义为导致器官功能障碍、细胞内信号通路异常激活、慢性炎症Z-VAD-FMK体内实验剂量和细胞死亡的脂质毒性,是非酒精性脂肪相关肝脏炎症损伤的标志。细胞焦亡作为细胞炎症相关的程序性死亡形式,在脂质毒性损伤中发挥重要作用,抑制细胞焦亡可能成为NAFLD潜在的治疗方式。长链非编码RNA(lnc RNAs)在物质代谢、免疫应答等过程中发挥重要的生物学作用,调节广泛的生物信号通路。lnc RNA核旁富集转录本1(NEAT1)已被证实参与内分泌代谢紊乱、肥胖病、心脏病等的疾病调控,还与趋化因子调节、细胞因子产生和炎症小体激活等炎症过程有关。然而,NEAT1是否参与脂毒性诱导的肝细胞焦亡,以及NEAT1调控焦亡相关炎症反应的具体分子机制值得进一步探索。本研究旨在确定NEAT1如何调节肝细胞脂质毒性诱导的细胞焦亡,并了解其潜在分子机制。方法:1.以Hep G2细胞为研究对象,分别使用棕榈酸(PA)、油酸(OA)及两者1:2比例混合物处理,使用CCK-8法检测不同游离脂肪酸处理细胞后细胞存活率的变化;甘油三酯(TG)酶法检测细胞培养上清中TG含量;定量反转录聚合酶链式反应(q RT-PCR)检测细胞凋亡、炎症和纤维化相关基因m RNA相对表达量,确定合适的诱导肝细胞体外脂质毒性损伤模型的方法。2.以梯度浓度PA处理Hep G2细胞,使用油红O染色观察细胞内脂质沉积情况,并以异丙醇融细胞内染色脂滴进行定量分析;TG酶法检测细胞TG释放量;乳酸脱氢酶释放(LDH)检测试剂盒检测细胞LDH释放量,确定PA诱导肝细胞体外脂质毒性损伤模型的合适浓度。3.选择0.25mmol/L PA处理Hep G2细胞,使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞焦亡相关炎症细胞因子IL-1β、IL-18的蛋白表达情况;利用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Cleaved caspase-1 p20的蛋白水平表达变化;q RT-LY-188011PCR检测NEAT1的基因相对表达量。4.以脂质体转染过表达质粒(pc DNA3.1-NEAT1)或小干扰RNA(siNEAT1),检测敲低或过表达NEAT1对PA诱导的Hep G2细胞焦亡的影响,使用q RT-PCR检测转染效率;CCK-8检测敲低或过表达NEAT1对PA刺激后Hep G2细胞活力的影响;LDH释放实验、ELISA及Western blot检测敲低或过表达NEAT1对PA刺激后Hep G2细胞焦亡的影响。5.以脂质体转染过表达质粒(pc DNA3.1-NEAT1)和(或)小干扰RNA(siNLRP3),检测敲低NLRP3及在过表达NEAT1基础上敲低NLRP3对PA诱导的Hep G2细胞焦亡的影响,使用q RT-PCR检测转染效率;CCK-8检测过表达NEAT1和(或)敲低NLRP3对PA刺激后Hep G2细胞活力的影响;LDH释放实验、ELISA及Western blot检测过表达NEAT1和(或)敲低NLRP3对PA刺激后Hep G2细胞焦亡的影响。结果:1.与空白对照组相比,PA处理组的细胞存活率显著降低,细胞中凋亡相关基因(Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3)、纤维化相关基因(α-SMA和Col.I)以及炎症相关基因(NLRP3和TNF-α)m RNA水平表达量均显著升高(P<0.05);与PA组相比,在PA基础上加入两倍浓度OA的混合物组细胞存活率升高(P>0.05),凋亡、纤维化及炎症基因m RNA水平表达量明显下调(P<0.05)。2.随PA浓度升高,Hep G2细胞的存活率降低,细胞上清中TG及LDH的含量升高;油红O染色结果以0.25mmol/L PA诱导细胞脂质沉积明显(P<0.05),提示0.25mmol/L PA处理Hep G2细胞24 h可成功建立肝细胞体外脂质毒性损伤模型。3.与空白对照组相比,0.25mmol/L PA诱导Hep G2细胞IL-1β、IL-18、NLRP3及Cleaved caspase-1 p20蛋白表达显著上调,长链非编码RNA NEAT1的基因表达显著上调(P值均<0.01)。4.与vector+PA组相比,NEAT1过表达组NEAT1及NLRP3基因表达显著上调,细胞存活率降低,LDH、IL-1β及IL-18显著升高,NLRP3蛋白表达量显著升高(P值均<0.05),但Cleaved caspase-1 p20蛋白表达无明显变化(P>0.05);与si-NC+PA组相比,敲低NEAT1组NEAT1及NLRP3基因表达显著下调,细胞存活率升高,LDH、IL-1β及IL-18显著降低,NLRP3及Cleaved caspase-1 p20蛋白表达量下降(P值均<0.05)。5.与Vector+si-NC+PA组相比,敲低NLRP3组NLRP3基因表达显著下调,LDH、IL-1β及IL-18显著降低,Cleaved caspase-1 p20蛋白表达量下降(P值均<0.05),NLRP3蛋白表达降低,但无统计学意义(P>0.05);与pc DNA3.1-NEAT1+si-NC+PA组相比,在过表达NEAT1的基础上敲低NLRP3可显著逆转过表达NEAT1对NLRP3基因、细胞LDH、IL-1β及IL-18的释放量以及NLRP3蛋白和Cleaved caspase-1 p20蛋白表达的促进作用,逆转细胞存活率的降低(P值均<0.05)。结论:在肝细胞体外脂质毒性损伤模型中,NEAT1可以通过靶向NLRP3基因表达调控炎症小体激活,促进PA诱导的肝细胞焦亡。