目前,肿瘤依然是危害公众健康的重大疾病之一,国际癌症机构2020年数据显示,中国是新发肿瘤排名第一的国家,严重影响人民的生命质量和健康,肿瘤治疗一直也是社会关注的问题。放射治疗是许多癌症治疗的基获悉更多石,利用高能电离辐射(IR)产生DNA双链断裂,诱导细胞周期阻滞、衰老和各种细胞死亡模式,包括凋亡、坏死、自噬和有丝分裂灾难等,最终达到杀死肿瘤细胞的目的。大量文献报道,中药与放疗、化疗或靶向治疗相结合可提高放射治疗效果,减少相关不良反应及并发症的发生,可改善患者的生活质量,延长生存时间。没食子酸(Gallic Acid,GA)广泛存在于五倍子等植物中并且具有多种生物学活性,包括抗癌、抗炎、抗病毒、抗感染、保护心血管、保护肝脏和增强生物膜性能等。没食子酸/卵磷脂复合物(Gallic Acid/Lecithin Complex,GA/LC)是由GA和磷脂摩尔质量比为1:1合成的纳米材料,磷脂毒性小、合成方法安全、简单,与母药GA结合,可提高GA的生物活性、生物利用度和药理活性,且制备得到的GA/LC具有保护肝脏以及抑制肿瘤细胞生长的作用,与其参与抗氧化/氧化作用有关。铁死亡是一种铁依赖性的,区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式,其主要机制是细胞膜中的含多不饱和脂肪酸的磷脂(polyunsaturated-fatty-acidcontaining phos-pholipids,PUFA-PLs)在富含铁和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的条件下易发生过氧化,也就是发生脂质过氧化,这种脂质过氧化物在细胞膜中的积累最终会破坏膜的完整性,从而诱导细胞死亡。本研究主要探讨药物GA/LC与电离辐射联合作用于非小细胞肺癌细胞后诱发脂质过氧化引起铁死亡,从而增强肿瘤细胞辐射敏感性的作用及分子机制。目的:探讨GA/LC介导铁死亡增强肺癌细胞放射敏感性的作用及分子机制,为辐射杀伤肿瘤细胞作用提供新的增敏剂。方法:1.采用数学模型和实验条件相结合的方式,确定GA/LC的最优制备条件,最终通过选用15 m L乙醇为反应溶剂(GA的质量浓度为12.5 mg/m L),1:1作为GA与磷脂的物质的量比,50℃作为反应温度,3 h为反应时间合成GA/LC。2.采用X-RAD 320i X深部辐照仪进行照射,照射条件为:电压180 k V,电流20 m A,靶皮距70 cm,剂量率1.02 Gy/min,剂量为6 Gy。3.采用CCK-8检测试剂盒检测GA/LC及照射因素对A549和H1299细胞增殖能力的影响,选择最佳药物作用剂量、作用时间及照射剂量。4.采用5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,Ed U)染色检测A549和H1299细胞经铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)预处理后,再进行GA/LC和辐射联合作用,观察细胞增殖能力的变化。5.采用流式细胞术检测A549和H1299细胞经过GA/LC与辐射处理后细胞线粒体膜电位及ROS的变化。6.采用克隆形成实验检测A549和H1299细胞经过GA/LC及辐射处理后细胞集落形成能力的变化。7.利用DCFH-DA探针检测GA/LC及辐射作用于A549和H1299细胞后ROS的产生情况,Cytation 3细胞成像多功能检测系统拍照观察荧光强度。8.组织铁(Fe)测定试剂盒检测A549和H1299经GA/LC及照射处理后细胞内铁含量的变化。9.丙二醛(MDA)检测试剂盒检测A549和H1299细胞经GA/LC及照射处理后细胞内MDA的含量的变化。10.Western blot检测蛋白Nrf2、GPX4、ACSL4、SLC7A11经GA/LC、辐射以及NAC和Fer-1预处理后的表达情况。11.Western blot检测SLC7A11抑制剂Erastin对上述蛋白表达的影响。12.利用SPSS 24.0进行统计学分析。细胞存活率、细胞周期分布百分率、细胞凋亡率、细胞内铁含量、MDA含量等均以x±s表示,经正态性检验均符合正态分布,多组间样本均数比较采用方差分析,组间两两比较采用独立样本t检验,P<0.05即认为差异具有统计学意义;使用Graph Pad SAHA采购Prism 8软件绘制结果图。结果:1.GA/LC浓度、时间和电离辐射剂量等条件的筛选GA/LC对A549和H1299细胞的增殖抑制程度随着药物浓度和作用时间的增加而增加,辐射对这两种细胞的增殖抑制随着照射剂量的增加而增加。经过IC_(50)计算并结合参考文献确定GA/LC的最佳作用浓度,A549细胞为0.16 mg/m L,H1299细胞为0.14 mg/m L,最佳作用时间为24 h,辐射剂量为6 Gy。2.GA/LC对A549和H1299细胞的增敏作用(1)GA/LC增强辐射所致A549和H1299细胞增殖抑制与Control组相比,GA/LC与6 Gy照射单独作用均可使A549和H1299细胞出现增殖抑制(P<0.05),并且当GA/LC与6 Gy照射联合作用时,两种细胞的增殖抑制效果更为明显(P<0.05)。(2)GA/LC抑制辐射后A549和H1299细胞克隆形成能力克隆形成实验也可观察到GA/LC和6 Gy照射联合作用对A549和H1299细胞集落形成能力的影响大于GA/LC与6 Gy单独作用,提示GA/LC对2种细胞起到增敏的作用。(3)GA/LC对辐射所致A549和H1299细胞迁移的影响GA/LC作用于A549和H1299细胞时,迁移能力与Control组相比有较大程度的降低,划痕间距较宽,当GA/LC与6 Gy照射联合作用时,迁移能力进一步减弱,划痕间距比单独处理更明显。3.GA/LC对辐射诱导的肺癌细胞线粒体及氧化损伤的影响(1)GA/LC可以协同辐射诱导的肺癌细胞ROS产生GA/LC处理A549和H1299细胞一定时间后与Control组相比,其ROS的产生增加,当GA/LC与6 Gy联合作用时,ROS产生明显多于单独作用(P<0.05),DCFH-DA探针染色显示荧光强度增加。(2)GA/LC联合辐射诱导的肺癌细胞MDA含量的增加GA/LC及6 Gy照射单独作用于A549及H1299细胞后,其MDA含量相比于Control组增加,GA/LC及6 Gy联合作用使得两种细胞内MDA含量增加(P<0.05)。在使用ROS清除剂NAC预处理后,联合作用使细胞内MDA含量的增加受到抑制。(3)GA/LC对辐射诱导的肺癌细胞氧化应激蛋白表达的影响与Control组相比,GA/LC及6 Gy处理A549和H1299细胞后均可使氧化应激相关蛋白Nrf2、GPX4和SLC7A11的表达降低,联合作用的降低效果更明显。而促氧化相关蛋白ACSL4在GA/LC与6 Gy作用后表达增加。(4)GA/LC对电离辐射诱导的肺癌细胞线粒体损伤的作用与Control组相比,GA/LC处理A549和H1299细胞一定时间后其线粒体膜电位降低,当GA/LC与6 Gy联合作用时,与单独作用相比线粒体膜膜电位进一步降低(P<0.05),线粒体损伤更严重。Mi To-Tracker Green探针染色进一步观察结果与流式细胞术结果一致,Control组荧光强度大且均匀分布于细胞质中,GA/LC和6 Gy照射单独作用使荧光强度降低,线粒体被破坏,线粒体膜完整性降低。二者联合作用使细胞膜完整性丧失,荧光微弱。4.GA/LC增强铁死亡增强肺癌细胞放射敏感性的作用及机制(1)Ed U染色结果显示铁死亡抑制剂Fer-1可以挽救GA/LC及6 Gy对A549和H1299细胞的增殖抑制,Ed U染色结果啊显示,相比于GA/LC及6 Gy处理组有所恢复。(2)克隆形成实验结果显示铁死亡抑制剂Fer-1可以降低GA/LC及6 Gy对A549和H1299细胞集落形成能力的影响。(3)铁离子检测结果显示铁死亡抑制剂Fer-1可以恢复GA/LC及6 Gy联合作用对A549和H1299细胞内铁离子含量的影响(P<0.05)。(4)与Control组相比,GA/LC及6 Gy处理A549和H1299细胞后均可使铁死亡相关蛋白Nrf2、GPX4和SLC7A11的表达降低,联合作用的降低效果更明显。蛋白ACSL4在GA/LC与6 Gy作用后表达增加,联合作用后表parenteral antibiotics达增加更明显,且铁死亡抑制剂Fer-1预处理可以减弱GA/LC及6 Gy照射对ACSL4的表达的影响。5.抑制SLC7A11对铁死亡的影响Erastin预处理后,与Control组相比,Erastin联合GA/LC和6 Gy处理A549和H1299细胞后SLC7A11蛋白呈下降趋势,且当Erastin、GA/LC和6 Gy三种处理因素同时作用于两种细胞时,SLC7A11的表达趋近消失。Nrf2与GPX4表达在Erastin预处理后出现明显的降低。A549细胞中ACSL4蛋白表达在经过GA/LC、6 Gy及Erastin处理后出现明显增加。但对于H1299细胞而言,SLC7A11的抑制使辐射对铁死亡的敏感性下降,同时GA/LC与6 Gy的联合作用也消失。这说明当SLC7A11的水平受到抑制后,A549和H1299细胞对铁死亡的敏感性受到明显影响。结论:1.GA/LC可通过增强辐射所致的克隆形成能力降低、迁移能力减弱,增殖抑制增加等增强肺癌细胞A549和H1299的放射敏感性。2.GA/LC可以增强辐射诱导的脂质过氧化水平增强,进而诱发铁死亡。3.铁死亡抑制剂Fer-1可以降低GA/LC增强放射敏感性的作用。4.SLC7A11抑制剂Erastin可以显著改变GA/LC对Nrf2/SLC7A11/GPX4通路相关分子表达的影响,该通路参与GA/LC诱导铁死亡增敏肺癌的分子调控。总的来说,GA/LC通过增加细胞内脂质过氧化水平,以介导铁死亡的方式增加电离辐射对A549和H1299细胞的敏感性。