背景及目的:高血压是靶向抗肿瘤药物最常见的心血管不良反应。其中,靶向血管内皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)可通过抑制酪氨酸激酶的磷酸化水平,抑制肿瘤细胞DNA的修复、阻断G1期细胞分裂、抑制血管内皮细胞生成等作用来实现抗肿瘤的效果。TKIs代表药阿帕替尼用于晚期胃癌或胃食管结合部腺癌的治疗,其预防和治疗与原发性高血压不同,引起高血压的发生率高,发病机制也有待进一步研究。因此,研究阿帕替尼在肿瘤患者治疗过程中发生高血压的相关机制,并寻找既能降压又不影响抗肿瘤疗效的化合物有重要价值。ROCK主要参与血管收缩的调节,Y27632是一种选择性的ROCK1和ROCK2的小分子抑制剂,可以抑制大鼠和人肿瘤细胞的侵蚀和转移。因此,Y27632可能会抵消VEGF抑制剂所致的血压升高作用,同时可促进阿帕替尼的抗肿瘤作用。我们团队前期在WKY大鼠模型中发现,阿帕替尼可经Rho A/ROCK信号通路导致大鼠血压升高,且既往研究显示舒尼替尼会加重高盐饮食(HSD)所致Rho A/ROCK信号通路的激活。因此我们提出研究假设,阿帕替尼治疗肿瘤也是通过Rho A/ROCK信号通路导致血压升高及盐敏感性增加。本研究通过模拟肿瘤环境进行体内实验,探讨Rho A/ROCK信号通路是否参与阿帕替尼治疗胃癌模型小鼠所致高血压的机制以及是否为血管和心脏重构的机制之一。同时探索ROCK通路抑制剂Y27632是否可预防和逆转阿帕替尼治疗胃癌引起的血压升高、血管和心脏重塑,为该类高血压的预防和治疗提供一定的理论依据。方法:采用4-6周龄SPF级Balb/c雌性裸鼠56只(20±5g),随机分为正常(NR)组(n=8只)和荷瘤(TB)组(n=48只)。选用人胃癌细胞系MKN-45对荷瘤组小鼠进行肿瘤造模,造模成功后小鼠随机分为6组进行4周的药物干预:(1)对照组:2ml生理盐水灌胃;(2)高盐饲料(定制8%高盐饲料);(3)高盐饲料(定制8%高盐饲料)+Y27632(10mg/kg?d)腹腔注射;(4)高盐饲料(定制8%高盐饲料)+阿帕替尼(50mg/kg?d)溶解于2ml生理盐水中灌胃;(5)阿帕替尼(50mg/kg?d)溶于2ml生理盐水灌胃;(6)阿帕替尼(50mg/kg?d)溶于2ml生理盐水中灌胃,Y27632(10mg/kg?d)腹腔注射。每周固定时间段监测各组小鼠收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MBP)水平,小动物超声评估各组小鼠药物干预前及干预结束后心脏功能的变化。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法以及蛋白印记法(WB)检测Rho A/ROCK信号通路、内皮型一氧化氮合酶(e NOS)以及内皮素-1(ET-1)蛋白表达及相应m RNAs水平以及平滑肌肌球蛋白轻链(MLC)、肌球蛋白磷酸酶靶向亚基1(MYPT-1)及磷酸化的MLC、MYPT-1蛋白水平。病理学组织染色H&E观察主动脉和心脏组织结构的改变,Masson染色观察主动脉和心脏组织中纤维化的程度,以及免疫组化检测主动脉中膜与心脏组织中胶原蛋白Iα1(COL1α1)、胶原蛋白IIIα1(COL3α1)以及平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平,比较心肌纤维化程度及血管僵硬度等的差异。最后,对小鼠肠系膜上动脉进行血小板-内皮细胞粘附分子(CD31)和e NOS免疫组化检测,观察阿帕替尼对小血管密度变化的影响。应用SPSS 23.0软件进行统计分析,Image J软件对蛋白条带进行半定量分析,Graph Pad Prism8.0进行绘图。结果:1.胃癌小鼠模型成功建立的证据:各组小鼠皮下有肿块长出,并且各组胃癌模型小鼠的肿瘤体积大于100mm3;剥离各组胃癌模型小鼠的肿瘤组织进行H&E染色发现呈肿瘤细胞样改变,表明胃癌小鼠模型建立成功。2.各组小鼠肿瘤体积的变化:阿帕替尼组肿瘤体积较对照组明显减小(p<0.001),联合Y27632干预后肿瘤体积与阿帕替尼组相比无统计学差异(p>0.05);高盐组肿瘤体积增长最明显,而联合Y27632干预后肿瘤体积较高盐组肿瘤体积明显减小(p<0.001)。3.各组小鼠体重的差异:与基线时体重相比,NR组明显增长,对照组明显下降,高盐组下降最为明显。高盐组给予阿帕替尼或给予Y27632干预后体重较高盐组明显增高(p<0.001);而阿帕替尼组小鼠体重较对照组升高(p<0.001),联合Y27632干预后体重较阿帕替尼组无统计学差异(p>0.05)。4.各组小鼠血压变化趋势:药物干预前各组小鼠血压无明显差异(p>0.05),胃癌模型建立1周后,各组小鼠血压暂时呈上升趋势,在实验第3周恢复到基线水平;在7-8周时,血压水平到达平台期。各组小鼠血压(SBP/DBP)结果:NR组(118.00/68.00±1.03/2.00 mm Hg),control组(104.00/58.00±1.75/2.62mm Hg),阿帕替尼组(158.83/101.83±2.71/1.54)、高盐饮食组(167.33/105.33±2.11/5.78 mm Hg)血压均显著升高,高盐组同时给予阿帕替尼后血压(188.17/133.67±2.07/1.17 mm Hg)升高最明显,呈叠加结果(p<0.001);而联合Y27632干预后,高盐饮食组(1Blebbistatin体外01.00/57.00±1.67/1.84mm Hg)、阿帕替尼组(98.17/66.17±1.25/3.51 mm Hg)血压均明显下降(p<0.001)。5.Rho A/ROCK信号通路的变化:阿帕替尼组、高盐饮食组Rho A、ROCK1、ROCK2蛋白水平和m RNAs水平以及P-MLC和P-MYPT蛋白水平均显著升高,而Y27632干预后阿帕替尼组、高盐饮食组其表达分别降低(p<0.001);高盐组同时予以阿帕替尼后,可使表达水平显著升高(p<0.001),呈叠加效应。6.各组小鼠血管内皮舒缩相关因子的变化:阿帕替尼组、高盐饮食组ET-1及e NOS蛋白水平、m RNAs水平均显著升高,联合Y27632干预后可降低阿帕替尼组、高盐饮食组的表达水平(p<0.001);高盐组同时予以阿帕替尼后,可使表达水平升高更为显著(p<0.001),呈叠加效应。7.各组小鼠主动脉组织学变化:阿帕替尼组、高盐饮食组小鼠主动脉血管腔面积变小,纤维化蓝染面积明显增加,高盐组给予阿帕替尼干预后会使这种现象更加明显,而联合Y27632干预后可使管腔面积增加,纤维化蓝染面积减少(p<0.001)。免疫组化以及q RT-PCR结果显示,阿帕替尼组、高盐饮食组小鼠主动脉中膜COL1和COLIII阳性信号以及m RNAs水平增加,高盐组给予阿帕替尼干预后阳性信号和m RNAs水平增加更加明显,而高盐组给予Y27632干预后则阳性信号和m RNAs表达水平降低(p<0.001)。8.各组小鼠小血管密度变化:免疫组化以及q RT-PCR显示阿帕替尼干预后,小鼠肠系膜上动脉中e NOS、血管密度标志性蛋白CD31阳性信号面积及m RNAs表达水平降低,Y27632干预后可使其增加(p<0.001)。9.各组小鼠心脏重构变化:心脏超声显示,左室后壁厚度(LVPW)、左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、心脏重量(HM)、左心室重量(LVM)在阿帕替尼组、高盐饮食组均升高,而给予Y27632干预后,则呈下降趋势(p<0.001);高盐饮食组同时给予阿帕替尼干预后升高最为显著,呈叠加趋势(p<0.001)。左室短收缩率(FS)和左室射血分数(EF)则出现与前述指标相反的趋势(p<0.001)。心脏组织HE和Masson染色提示,阿帕替尼组、高盐饮食组细胞出现排列紊乱,肌纤维断裂,组织间隙变宽,心脏纤维化蓝染面积增加,这种现象在高盐饮食+阿帕替尼组最为显著,也同样呈叠加效应(p<0.001)。而联合Y27632干预后阿帕替尼组、高盐饮食组心肌纤维化蓝染面积均减小(p<0.001)。免疫组化以及q RT-PCR结果显示阿帕替尼组、高盐饮食组小鼠心脏组织中α-SMA阳性信号、COL1和COLIII相关因子的m RNAs表达水平增加,而Y27632干预后则阳性信号减少,同时m RNAs水平也呈降低趋势(p<0.001);高盐组同时给予阿帕替尼干预后阳性信号和m RNAs水平均显著增加,呈叠加趋势(p<0.001)。结论:1.在胃癌小鼠模型中,阿帕替尼对胃癌具有较好的治疗效果,且与Y27632联合使用不影响阿帕替尼的抗肿瘤治疗效果。2.阿帕替尼可通过激活Rho A/ROCK信号通路,并导致胃癌小鼠模型中主动脉血管重塑、肠系膜上动脉血管损伤及小血管密度稀疏,进而引起胃癌模型小鼠血压升高。3.Y27632可降低阿帕替尼所致胃癌模型小鼠的血压升高,并可逆转阿帕替尼所致胃癌小鼠模型中主动脉血管重塑、肠系膜上动脉血管损伤及小血管密度稀疏。4.给予Y27632可逆转和改善阿帕替尼导致的胃癌小鼠模型左心室肥厚和纤维化改变。5.阿帕替尼通过Rho A/ROCK信号通路导致胃癌小鼠模型盐敏感性增加,进而加重高血压的发生,呈叠加效应。6.Rho A/ROCK通路抑制剂Y27632也可能对阿帕替尼所致的盐敏感性高血压有一定的治疗价值。背景及目的:第一部分实验已经证实阿帕替尼可通过Rho A/ROCK信号通路引起血管重构、小血管密度稀疏等,导致胃癌模型小鼠血压升高。而血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖和侵袭是高血压以及血管重塑的主要原因之一。因此,Rho A/ROCK信号通路的激活可能是阿帕替尼导致小鼠主动脉血管平滑肌细胞(MOVAS)功能障碍的潜在机制之一。白细胞相关因子Rho鸟苷转移因子12(ARHGEF12,LARG)是Rho A/ROCK信号通路的关键基因。LARG主要在血管中表达,负责响应机械应变Rho A的激活。由于LARG可以调节VSMCs的部分信号转导,因此在血管收缩功能中起着关键作用,缺乏LARG基因,可降低血压的异常升高,但不会改变正常的血压调节。因此,LARG介导的信号通路可成为抗高血压治疗的新靶点。VSMCs在外界刺激下能够转换为未分化的合成表型,进一步发挥增殖、迁移、合成细胞外基质的作用,这种改变会导致VSMCs的异常增殖。增殖与线粒体自噬对维持血管正常功能和结构具有重要作用,当增殖与线粒体自噬的平衡被打破时,线粒体自噬过度激活,进而导致能量损伤、活性氧增加,也会进一步引起VSMCs的异常增殖,从而诱发高血压的发生。我们Watson for Oncology提出研究假设ROCK抑制剂Y27632或LARG基因敲低可改善阿帕替尼引起的MOVAS细胞异常增殖和侵袭,LARG基因敲低对阿帕替尼引起的高血压也可能具有潜在的治疗价值。本实验通过体外实验观察Y27632与阿帕替尼联用是否可减轻阿帕替尼诱导的MOVAS细胞损伤以及进一步通过敲低LARG基因,观察是否可以改善阿帕替尼引起的MOVAS细胞的异常增殖、侵袭和损伤,在细胞层面更深层次探究此类高血压的发生机制及干预措施。方法:设置不同浓度梯度(0,2.5,5,10)μmol/l的阿帕替尼干预MOVAS细胞48h,通过细胞计数试剂盒(CCK8)、流式细胞术、细胞划痕实验以及免疫荧光等实验方法观察不同浓度梯度的阿帕替尼对MOVAS细胞增殖、凋亡以及侵袭能力的影响。同时检测阿帕替尼是否可影响MOVAS细胞中血管平滑肌细胞功能相关因子e NOS、ET-1以及α-SMA蛋白水平的表达。采用q RT-q PCR法以及WB法检测Rho A/ROCK信号通路相应m RNAs以及蛋白水平表达。同时观察联合给予Y27632(10μmol/l)是否可以改善阿帕替尼导致的MOVAS细胞功能障。进一步使用慢病毒转染技术构建LARG基因敲低细胞系,设置不同的分组:对照组,阿帕替尼组(10μmol/l),sh RNA-LARG基因敲低Decitabine试剂组以及sh RNALARG基因敲低+阿帕替尼(10μmol/l)组。采用q RT-q PCR以及WB检测Rho A/ROCK通路中蛋白表达及相应m RNAs水平。免疫荧光检测LARG基因对阿帕替尼所致MOVAS细胞中e NOS、ET-1以及α-SMA蛋白及相应m RNAs水平的影响。最后采用流式细胞术、免疫荧光以及线粒体膜电位、WB检测观察LARG敲减之后对MOVAS的影响以及是否可以逆转阿帕替尼所致的MOVAS细胞异常增殖、细胞周期的改变以及线粒体膜电位、线粒体自噬相关蛋白的变化。应用SPSS 23.0软件进行统计分析,Image J软件对蛋白条带进行半定量分析,Graph Pad Prism8.0进行绘图。结果:1.阿帕替尼对Rho A/ROCK信号通路的影响:不同浓度的阿帕替尼均可引起Rho A、ROCK2m RNAs以及蛋白表达水平增加(p<0.001),当浓度达10μmol/l时ROCK1m RNAs以及蛋白表达水平出现增加趋势(p<0.001);Y27632可降低阿帕替尼(10μmol/l)引起的Rho A、ROCK2的m RNAs以及蛋白表达水平升高(p<0.001),但不能降低ROCK1的m RNAs以及蛋白表达水平的升高。2.CCK8、细胞划痕实验以及细胞流式结果:随着阿帕替尼浓度的增加,MOVAS的增殖率逐渐增加,划痕下面积逐渐减小(p<0.001),而MOVAS的凋亡率在仅10μmol/l时增加(p<0.001)。联合给予Y27632干预后,在不同的浓度梯度下均可抑制MOVAS的增殖率,增加MOVAS的划痕下面积以及凋亡率(p<0.001)。3.免疫荧光结果:随着阿帕替尼浓度的增加,α-SMA、e NOS的阳性信号表达逐步减少,ET-1、i NOS的表达逐步增加(p<0.001);联合给予Y27632干预,α-SMA、e NOS的表达逐步增加,ET-1、i NOS的表达逐步减少(p<0.001)。4.LARG基因敲低后Rho A/ROCK信号通路的变化:WB以及q RT-PCR结果:sh RNA-LARG基因敲低可显著降低阿帕替尼引起的Rho A、ROCK1、ROCK2 m RNAs以及蛋白表达水平;同时可降低p-MLC和p-MYPT蛋白水平(p<0.001)。5.LARG基因敲低后MOVAS细胞周期变化:sh RNA-LARG基因敲低可显著降低阿帕替尼引起的MOVAS细胞S%期+G2/M%期占比增高(p<0.001)。6.LARG基因敲低对MOVAS细胞凋亡的影响:阿帕替尼可引起MOVAS细胞凋亡率、caspase-3蛋白表达水平的降低以及BAX/BCL2比值增加(p<0.001);sh RNA-LARG基因敲低可显著增加MOVAS细胞的凋亡率、caspase-3蛋白表达水平,同时降低BAX/BCL2比值(p<0.001)。7.LARG基因敲低对MOVAS细胞线粒体自噬的影响:sh RNA-LARG基因敲低组Beclin-1、LC3 II/LC3 I蛋白水平较对照组降低(p<0.001);LARG基因敲低也可改善阿帕替尼引起的MOVAS细胞中beclin-1、LC3 II/LC3 I蛋白水平升高(p<0.001)。8.LARG基因敲低后MOVAS细胞活性氧ROS的变化:sh RNA-LARG基因敲低可降低MOVAS细胞的ROS,并显著改善阿帕替尼所致的ROS比例增加(p<0.001)。9.7.LARG基因敲低对MOVAS细胞功能相关因子的影响:q RT-PCR以及免疫荧光结果显示,sh RNA-LARG基因敲低可使MOVAS细胞的α-SMA、e NOS的阳性信号表达增加,ET-1、i NOS的表达水平降低(p<0.001);LARG基因敲低还可改善阿帕替尼引起的e NOS/i NOS比例失调(p<0.001)。结论:1.阿帕替尼可通过Rho A/ROCK信号通路导致MOVAS细胞增殖率、细胞迁移能力增强以及凋亡能力减弱,导致MOVAS细胞异常增殖。而Y27632通过抑制该信号通路的激活可改善阿帕替尼所致MOVAS细胞异常增殖。2.敲低LRAG基因不仅可以缩短MOVAS的增长周期、增加MOVAS细胞的凋亡率,降低MOVAS细胞的迁移能力,同时还可以改善阿帕替尼所致的MOVAS细胞周期延长、凋亡能力异常降低、迁移能力异常增加。3.阿帕替尼可增加自噬相关蛋白的表达以及改变线粒体膜电位,引起MOVAS细胞线粒体自噬的发生,而LRAG基因敲低可缓解阿帕替尼所致的线粒体自噬,进一步改善MOVAS细胞的损伤。4.敲低LRAG基因可降低阿帕替尼引起的MOVAS细胞中线粒体膜电位损伤所致的ROS增加,因此,LRAG基因敲低可能会改善阿帕替尼引起的氧化应激反应。5.敲低LRAG基因可改善阿帕替尼导致的MOVAS细胞i NOS/e NOS比例失调、ET-1及α-SMA异常表达。因此,敲低LRAG基因的可改善阿帕替尼所致的MOVAS细胞表型转换所致的细胞异常收缩、细胞功能障碍。6.通过探索阿帕替尼对MOVAS细胞的损伤机制发现阿帕替尼引起MOVAS细胞增殖的主要机制有细胞凋亡率下降、增殖能力增强、迁移能力增加,细胞增殖周期缩短、触发线粒体自噬、活性氧表达增加、细胞表型转换以及细胞功能障碍等,而敲低LRAG基因以及给予Y27632可改善上述情况。为TKIs治疗肿瘤所致高血压提供治疗依据和方向。心血管疾病与肿瘤是导致全世界范围内死亡率增高的两个主要原因,众多研究证明两者之间存在密切的联系。但随着肿瘤靶向治疗技术的推进,肿瘤患者生存期不断延长,心血管事件已逐渐成为肿瘤患者死亡的重要原因之一。这种现象的出现,一方面由于抗肿瘤治疗的心血管毒性作用导致心血管不良反应的发生,另一方面由于预期寿命延长使高龄患者同时患有肿瘤及心血管疾病的比例增加。肿瘤的生长及存活依赖于新血管充足的血液供应。随着实体瘤的生长,中央核心变得缺氧,这一过程可使肿瘤组织释放血管生成生长因子,刺激新血管形成。这些新生的血管为肿瘤的生长提供其所需要的营养和水分,同时向远处扩散肿瘤细胞。而抗血管生成药物可通过清除实体肿瘤生长和转移所必需的血管,对肿瘤血管进行特异性、靶向性阻断,从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤细胞表达的血管内皮生长因子(VEGF)是最重要的促血管生成因子,可在体内诱导血管的新生以维持肿瘤的生长,通过阻断VEGF与内皮细胞表面受体的结合,抑制新生血管的形成。因此,抑制VEGF信号通路成为了肿瘤治疗中的主要治疗靶标。VEGF信号通路抑制剂包括VEGFA因子的单克隆抗体、血管内皮生长因子抑制剂(VEGF trap)、VEGF受体的单克隆抗体以及小分子络氨酸激酶抑制剂(TKIs)等。TKIs是有效的信号级联抑制剂,通过抑制血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制肿瘤血管生长,VEGFR-TKIs已成为许多实体恶性肿瘤的主要治疗手段。然而,TKIs既可通过作用于其靶点VEGFR、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)和干细胞因子受体(SCFR)等导致血管内皮受损、高血压和心肌损伤的发生;也可通过“脱靶点效应”,损伤线粒体、影响心肌能量代谢,最终导致心血管并发症的发生。因此,VEGFR-TKIs相关的心血管毒性的发生率很高,可引起高血压、左心室收缩功能障碍/心力衰竭、动脉粥样硬化形成等心血管并发症的发生及发展。抗肿瘤治疗所带来的心血管毒性等副作用,成为了限制其抗肿瘤治疗发展的主要原因之一。因此,抗肿瘤治疗的目标是最大限度地提高抗肿瘤效果的同时减少治疗相关的心血管事件,寻找新的特异性治疗药物,对于抗肿瘤治疗的顺利应用、预防相关心血管事件及改善患者预后均至关重要。