【研究背景与目的】原发性高血压(Essential Hypertension)是心血管疾病的主要危险因素,显著增加脑卒中、缺血性心脏病、慢性肾病和其他器官并发症的发生风险。交感神经对维持心血管系统功能稳定发挥重要作用。当机体在高血压病理状态下,交感神经系统兴奋性异常增强。大量研究表明交感中枢头端延髓腹外侧区(Rostral Ventrolateral Medulla,RVLM)对血压和交感神经活动发挥重要的调控作用,该核团包含的C1神经元不仅能接受来自众多心血管核团的调控信息,也能整合来自外周心血管活动的传入信息。RVLM在对这些信息进行复杂的整合后,发出神经纤维进一步调控外周心脏、肾脏和血管等器官的功能。因此,重点围绕高血压状态下RVLM结构和功能的异常开展研究对阐明高血压交感输出增强机制和探索防治策略非常关键。肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System,RAS)是心血管功能体液调节的主要系统之一,并且中枢RAS系统包括所有外周RAS必要的前体、酶和代谢成分。其中,中枢血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)可以通过作用于下丘脑和脑干等区域导致血压升高,但同时Ang II的降解产物血管紧张素-(1-7)[Angiotensin-(1-7),Ang-(1-7)]可以通过作用于Mas受体(Mas Receptor,Mas R)发挥与Ang II相反的作用,因此,维持中枢RAS系统Ang II和Ang-(1-7)的平衡在血压调节和高血压的发生发展中发挥关键作用。目前通过靶向Ang II生成和作用的血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor,ACEI)和血管紧张素II的1型受体阻滞剂(ARB)类药物已广泛应用于高血压的治疗。由此可见,维持RAS系统的平衡对机体血压调控至关重要,同时促进Ang-(1-7)的生成或抑制其降解是调节RAS平衡的另一关键途径。但是目前利用合成的Ang-(1-7)拟似物,延缓其降解治疗高血压的效果并不理想。提示Ang II和Ang-(1-7)平衡可能还存在其他的调控途径。因此,探索参与维持Ang II和Ang-(1-7)平衡的新机制将为阐明血压中枢调节和高血压防治提供新的思路。二肽基肽酶3(Dipeptidyl Peptidase 3,DPP3)是一种最早从牛垂体前叶中分离出来主要分布在胞质内的锌依赖性水解酶,可特异性参与降解具有4-12个氨基酸残基的寡肽[例如:Ang II、Ang-(1-7)、脑啡肽和内啡肽等]。这一结果表明DPP3与RAS系统密切相关,它可以将八肽的Ang II酶促裂解,同时也能将Ang-(1-7)裂解为血管紧张素-(3-7)[Angiotensin-(3-7),Ang-(3-7)]和血管紧张素-(5-7)[Angiotensin-(5-7),Ang-(5-7)]。大量研究报道DPP3与多种病理生理过程有关,包括血压调节、疼痛信号转导和癌细胞对氧化应激的防御反应。此外,循环DPP3水平与心源性休克、脓毒症以及烧伤患者的死亡率也密切相关。根据大鼠基因组数据库发布的11个器官的RNA转录组图谱结果发现DPP3在中枢神经系统中有表达,但DPP3是否通过改变Ang II和Ang-(1-7)平衡参与高血压的发病机制尚未明确。因此,阐明中枢DPP3对血压和交感神经调控的作用特点和意义对明确高血压的发病机制具有重要意义。Ang Ⅱ和Ang-(1-7)均可被DPP3水解,其中DPP3裂解Ang-(1-7)生成的Ang-(3-7)已被证明可以促进纹状体中多巴胺和γ氨基丁酸的释放,也可作用于RVLM前交感神经元,升高血压。这些研究结果表明DPP3水解产生的Ang-(3-7)在高血压的发病机制中具有重要意义。此外,Ang-(3-7)可以被DPP3进一步裂解产生Ang-(5-7),但Ang-(5-7)是否与Ang-(3-7)一样具有血压中枢调控作用也不清楚。基于上述研究背景,我们提出本课题的研究假设,即中枢RVLM内DPP3通过调控Ang-(5-7)的水平,增强交感神经输出,促进高血压的发生发展。本研究致力于探讨中枢DPP3在血压调控中的作用,将为阐明高血压的发生机制和防治策略提供新的研究方向和理论依据。【研究方法】首先,我们收集了心血管疾病患者血浆,检测血浆中DPP3及去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)水平。其次,我们选取不同周龄正常血压的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠和自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rat,SHR)检测其血浆中DPP3及NE水平,并将DPP3与NE水平进行了相关性分析。此外,我们检测了WKY大鼠和SHR心血管系统和相关组织器官Cell Analysis中DPP3的表达情况,并在大鼠双侧RVLM核团内微量注射DPP3过表达或干扰的腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV),观察中枢DPP3对交感神经及血压调控的作用。由于中枢RAS系统在血压和心血管功能调控中发挥重要作用,通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)、酶活性检测和液质联用定量检测的方法,我们进一步明确RVLM内DPP3参与中枢RAS系统对血压的调节作用。最后,为阐明经DPP3酶促产生的Ang-(5-7)参与血压调控的作用和机制,本研究通过药物第四脑室灌流和脑核团微量注射的技术,观察中枢给予Ang-(5-7)对血压、心率和肾交感活性的影响,同时利用二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)荧光探针染色、免疫荧光技术检测活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)和神经元激活标志物c-fos的表达水平,证实RVLM内经DPP3酶促产生的Ang-(5-7)可以激活交感神经活性促进高血压的发生发展。【结果】一、DPP3对心血管功能的作用和意义(一)DPP3与交感亢进的关系及其表达与分布1.在心血管疾病患者和大鼠血浆中,DPP3水平与NE水平呈正相关。2.相较于WKY大鼠,SHR的肾脏皮质和RVLM内DPP3表达明显升高。同时,各年龄组SHR的RVLM中DPP3水平均高于WKY大鼠,并且随着年龄的增加,RVLM内DPP3水平也升高。此外,通过免疫荧光检测发现WKY大鼠RVLM神经元上存在DPP3的表达。(二)RVLM内DPP3可升高交感神经活性和血压1.在WKY大鼠双侧RVLM内急性微量注射不同浓度的DPP3,发现血压和肾交感活性(Renal Sympathetic Nerve Activity,RSNA)升高,且呈现剂量依赖性变化。2.WKY大鼠RVLM内注射DPP3过表达腺相关病毒(WKY-DPP3组)后,在RVLM内观察到病毒所转染的GFP荧光且DPP3的表达水平升高CX-5461试剂。同时,清醒和麻醉状态下大鼠血压相较于对照组(WKY-GFP组)均显著增加[清醒状态收缩压:123.5±1.3 vs.161.0±1.2 mm Hg;麻醉状态平均动脉压(Mean Arterial Pressure,MAP):114.6±4.7 vs.143.3±6.2 mm Hg,P<0.05],而且WKY-DPP3组注射溴化六烃季铵阻断交感神经节后,MAP降低幅度(ΔMAP)较对照组明显增大(43.7±4.3 vs.83.2±2.1 mm Hg,P<0.05)。3.SHR的RVLM内注射DPP3干扰腺相关病毒[SHR-sh RNA(DPP3)组]后,大鼠清醒和麻醉状态下血压降低,且注射溴化六烃季铵后,相较于对照组(SHR-GFP组),其ΔMAP显著减小(107.6±4.4 vs.49.8±7.8 mm Hg,P<0.05)。二、RVLM内DPP3调节Ang-(5-7)的产生促进交感亢进血压升高(一)WKY大鼠RVLM内过表达DPP3后Ang-(5-7)产生增加在WKY大鼠双侧RVLM内过表达DPP3后,检测RVLM内DPP3主要底物[β-内啡肽、脑啡肽、Ang II和Ang-(1-7)]的含量变化,我们发现Ang II含量升高,Ang-(1-7)含量降低,且Ang-(1-7)和Ang II的比值降低(P<0.05 vs.WKY-GFP),而β-内啡肽和脑啡肽的含量均无显著的统计学差异。同时血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)和血管紧张素转化酶2(Angiotensin Converting Enzyme 2,ACE2)的活性均升高(P<0.05 vs.WKY-GFP),而ACE、ACE2的表达水平和Ang II-1型受体(Angiotensin II Receptor 1,AT1R)、Ang II-2型受体(Angiotensin II Receptor 2,AT2R)和Mas R表达水平均无明显的统计学差异。并且检测DPP3水解Ang-(1-7)的产物[Ang-(3-7)和Ang-(5-7)]含量的变化,结果显示Ang-(3-7)的含量约升高2倍,Ang-(5-7)的含量约升高5倍。(二)SHR的RVLM内干扰DPP3后Ang-(5-7)产生减少在SHR的双侧RVLM内干扰DPP3后,Ang Ⅱ含量降低,Ang-(1-7)含量升高,且Ang-(1-7)和Ang II比值升高,脑啡肽含量降低(P<0.05 vs.SHR-GFP),而β-内啡肽的含量、ACE和ACE2的活性以及ACE、ACE2和AT1R、AT2R和Mas R的表达水平均无显著的统计学差异。此外,Ang-(5-7)的含量明显降低(P<0.05 vs.SHR-GFP),而Ang-(3-7)的含量无明显统计学差异。三、RVLM内Ang-(5-7)对心血管活动调控的作用特点(一)RVLM内急性微量注射Ang-(5-7)增加肾交感活性升高血压在双侧RVLM内微量注射不同浓度的Ang-(5-7),发现10、100 ng/100nl的Ang-(5-7)微量注射于RVLM后MAP均显著升高[P<0.05 vs.人工脑脊液(Artificial Cerebrospinal Fluid,a CSF)]。(二)第四脑室慢性灌流Ang-(5-7)增加交感活性升高血压在WKY大鼠的第四脑室分别灌流a CSF、Ang Ⅱ和Ang-(5-7),发现连续灌流7天Ang II和Ang-(5DS-3201浓度-7)后,血压和心率变异性(Heart Rate Variability,HRV)均明显升高,且Ang II和Ang-(5-7)两组之间无统计学差异,但是Ang-(5-7)组压力反射敏感性(Baroreflex Sensitivity,BRS)功能较Ang II组下降更加显著(P<0.05 vs.Ang II)。四、RVLM内Ang-(5-7)对心血管活动调控的作用机制(一)干预RVLM内DPP3表达对氧化应激和神经元活性的影响通过检测RVLM内活性氧水平,我们发现WKY大鼠RVLM内过表达DPP3内源性增加Ang-(5-7)后ROS水平明显升高,且神经元活性标志物c-fos表达水平升高。而SHR大鼠RVLM内干扰DPP3内源性降低Ang-(5-7)后ROS水平降低,同时c-fos表达水平也降低。(二)RVLM内Ang-(5-7)通过增强氧化应激升高血压我们在WKY大鼠RVLM预先微量注射超氧化物歧化酶拟似物tempol后再注射Ang-(5-7),发现Ang-(5-7)的升压效应可被部分阻断(P<0.05 vs.a CSF)。【结论】中枢RVLM内DPP3的表达异常与高血压的发生发展密切相关。RVLM内DPP3通过促进Ang-(5-7)产生,引起氧化应激增强,导致交感输出亢进和血压升高。本研究结果明确了中枢DPP3通过调节RAS系统参与交感亢进的作用机制,为阐明血压中枢调节机制和高血压发病机理提供了新的思路。