沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌,含有2600多个血清型。其中肠炎沙门菌与鸡白痢沙门菌是感染禽类的主要沙门菌血清型,感染力和致病性强,给养殖业造成了巨大的威胁。沙门菌感染禽类后能刺激机体产生较强的体液免疫应答,从而清除胞外的沙门菌,但是对于侵入胞内的沙门菌的杀伤作用需要细胞免疫的参与。沙门菌通过抑制宿主的T细胞免疫应答,介导免疫逃逸,促使其在胞内的持续存活。因此研发用于禽沙门菌病免疫防控疫苗和药物,亟待解决鸡T细胞免疫应答测定的问题。本研究针对国内外鸡免疫应答检测的商品化试剂盒和抗体的缺乏等问题,建立鸡免疫细胞的体外分离技术及鸡巨噬细胞-T细胞的体外互作模型,并通过沙门菌感染后T细胞免疫应答的检测评价了该模型的应用前景。本研究通过优化流式分选的上机体系分选具有高活性的鸡原代T细胞,探究体外培养温度、血清种类、血清浓度以及是否需要添加刺激剂及生长因子等相关因素,从而确定T细胞的最佳培养条件,降低细胞的死亡率。在此培养条件下,建立鸡原代巨噬细胞和T细胞体外互作模型,研究T细胞与禽源沙门菌感染的巨噬细胞互作后细胞因子的表达及诱导的T细胞应答类型,为体外研究沙门菌引起鸡原代免疫细胞的应答提供技术和方法。1.基于流式分选的鸡TC59体外细胞体外培养技术的建立为了降低从 PBMCs(Peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)中分选出的 T细胞死亡率,本研究在抗凝剂的选择、细胞洗涤缓冲液中BSA的浓度、分选时的上机体系和T细胞的培养条件等方面进行了优化。在抗凝剂的选择中,利用凋亡检测比较了肝素钠、肝素锂和柠檬酸钠对鸡外周血PBMC活性的影响,最终选择肝素锂作为抗凝剂。其次通过流式细胞术比较了不同缓冲体系对鸡PBMC活性的影响,发现细胞在含有1%BSA的PBS中存活更稳定。通过使用FACSAria比较Purity和Yield两种常用的分选模式对PBMCs中分选T细胞纯度的影响,结果显示使用Purity模式能获得更高纯度的T细胞,达98.3%,且使用含有2.5%BSA的PBS作为上机体系时T细胞死亡率最低。我们进一步优化了 T细胞的培养条件。首先确定了 37℃培养的T细胞死亡率显著低于42℃;其次分析了细胞培养基中分别添加10%鸡血清、10%FBS和5%FBS+5%鸡血清对T细胞死亡率的影响,结果表明使用10%FBS的培养基能显著降低T细胞的死亡率。综上,我们选用肝素锂作为抗凝剂,使用1%BSA PBS作为洗涤缓冲体系,在2.5%BSA PBS的体系条件下,选择Purity模式对T细胞进行分选,将RPMI1640+10%FBS作为细胞培养基以及37℃作为细胞培养温度。上述研究对建立巨噬细胞-T细胞体外互作模型的培养条件进行了探索,从而为体外互作模型的建立提供了基础。2.沙门菌感染鸡原代巨噬细胞-T细胞互作模型的免疫应答研究为了建立体外互作模型,我们使用PBMCs贴壁48 h的方法获得鸡原代巨噬细胞(chMDM)PD-0332991作为抗原递呈细胞,并测定了肠炎沙门菌对鸡原代巨噬细胞的黏附、侵袭能力和胞内增殖能力。结果显示肠炎沙门菌C50041菌株以MOI=10感染巨噬细胞后,黏附率约为7%,侵袭率约为5%。我们深入比较了肠炎沙门菌C50041、鸡白痢沙门菌C79-13和缺失株C79-13ΔpSPI12在感染鸡原代巨噬细胞5 h后细胞因子mRNA表达水平,结果表明肠炎沙门菌感染组的IL-6、iNOS、CXCLi1和IL-1βmRNA表达水平均极显著高于鸡白痢沙门菌感染组,即肠炎沙门菌比鸡白痢沙门菌更能引起巨噬细胞的炎症反应,与已有研究结果一致,表明鸡原代巨噬细胞可作为体外互作模型中的抗原递呈细胞。利用流式细胞术从沙门菌免疫的鸡中获得T细胞,将其与受相应沙门菌感染后的巨噬Immune adjuvants细胞共培养72 h,发现肠炎沙门菌能够引起T细胞产生较高水平的IL-6、IL-1β、CXCLi1和CXCLi2,以诱导Th1型细胞免疫应答为主,而鸡白痢沙门菌引起T细胞产生较高水平的IL-4,诱导Th2倾向性的细胞免疫应答。同时,我们将从鸡白痢沙门菌C79-13和缺失株C79-13ΔpSPI12(ipaJ缺失株)感染的鸡中获得脾脏T细胞,与巨噬细胞共培养,发现脾脏T细胞与C79-13ΔpSPI12感染后的巨噬细胞共培养后,产生了较高水平的iNOS、CXCLi1和CXCLi2,表明ipaJ的缺失导致鸡白痢沙门菌诱导Th1型细胞免疫应答与炎症反应,这与前期报道的IpaJ抑制宿主Th1应答和炎症反应的结论一致。以上研究证实了本研究所建立的鸡原代巨噬细胞—T细胞互作模型可以应用于沙门菌感染鸡的免疫应答研究,为研究禽源沙门菌感染鸡产生的免疫应答效应提供了新技术与新方法。