结直肠癌是起源于结直肠黏膜上皮的恶性肿瘤,中国每年结直肠癌新发病例超过25万,死亡病例约14万,并有上升的趋势。近几年来由于人们生活水平的提高和饮食结构的改变,患结直肠癌的人数在总癌症患者中的比例逐渐升高。结直肠癌的治疗方式往往根据患者的癌症分期所确定,对于早期结直肠癌患者,采用微创手术切除病灶部位是最常用的治疗方法,而对于中晚期的患者,除去手术切除外还应配合化学治疗、分子靶向治疗或者免疫治疗等。但是化疗、放疗等疗法所带来的毒副作用以及获得性耐药的出现往往会严重影响患者的预后情况,造成肿瘤复发、转移等现象的发生。双硫仑(Disulfiram,DSF)原本是戒酒用药,主要通过不可逆的抑制乙醛脱氢酶导致乙醛在体内堆积使饮酒者出现剧烈头痛、潮红、焦虑、心动过速等身体不适的现象,从而使酗酒者对饮酒产生厌恶与恐惧达到戒酒的目的。随着双硫仑临床应用的深入,人们发现双硫仑具有铜依赖性的广谱抗肿瘤作用,双硫仑联合铜可通过抑制肿瘤干细胞、抑制肿瘤细胞增殖与迁移、诱导肿瘤细胞凋亡等机制发挥Biomagnification factor疗效。鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 3(Guanine Nucleotide Binding Protein Like 3,GNL3)作为一种GTP结合蛋白,在多种干细胞、癌细胞中呈现高表达的趋势。GNL3通过与体内包括p53、鼠双微体2(MDM2)、细胞衰老抑制基因蛋白(RSL1D1)在内的多种蛋白质结合,参与细胞的自我更新、细胞周期调节、细胞凋亡和细胞增殖等多种细胞进程。结合GNL3在结直肠癌细胞中的高表达以及其对多种细胞生物进程的影响作用,可以把GNL3作为结直肠癌患者的一个有效预后指标用于评估患者的治疗情况。目前临床上有关双硫仑用于结直肠癌治疗的研究较少,因此本课题旨在探究双硫仑联合铜对结直肠癌细胞生物学特性的影响以及其所涉及的分子机制,研究内容主要包括以下三部分:(1)DSF/Cu抑制结直肠癌细胞增殖与迁移的体外药效学研究;(2)DSF/Cu抑制结直肠癌生长与转移的体内药效学评价;(3)DSF/Cu治疗结直肠癌的分子作用机制的探索。(1)DSF/Cu抑制结直肠癌细胞增殖与迁移的体外药效学研究:选取HCT116、LOVO、SW480三株结直肠癌细胞评价了 Cu、DSF、DSF/Cu对它们的细胞毒性,随后选取HCT116细胞进行克隆形成实验、细胞划痕实验和Transwell实验。MTT实验结果表明双硫仑呈铜依赖性抑制结直肠癌细胞增殖能力,随着药物浓度的增加以及干预时间的延长对细胞的生存率影响越强,DSF/Cu对HCT116、LOVO、SW480三株结直肠癌细胞在 24 h/48 h/72 h 的 IC50 值分别是 482.6 nM/323.6 nM/316.0 nM、384.5 nM/317.1 nM/292.3 nM、381.1 nM/314.6 nM/249.9 nM;克隆形成实验结果表明 DSF/Cu 组相比Cu与DSF组细胞克隆球形成数目减少,进一步说明了 DSF/Cu能够抑制HCT116的增殖能力。细胞划痕实验与Transwell实验结果证明了 DSF/Cu能够显著抑制结直肠癌细胞HCT116的迁移能力。(2)DSF/Cu抑制结直肠癌生长与转移的体内药效学评价:采用HCT116细胞建立裸鼠皮下瘤模型以及裸鼠尾静脉转移模型,两种模型中均设置了对照组与DSF/Cu给药组(50 mg/kg)。在皮下移植瘤模型组中,给药结束后剥离瘤组织并进行Ki67免疫组化实验,实验结果表明DSF/Cu给药组的裸鼠皮下瘤体积以及Ki67蛋白阳性表达均明显小于对照组,结果说明DSF/Cu能够抑制结直肠癌细胞在体内的生长,药物抑瘤率为44.03%。尾静脉转移组连续给药30天后,取裸鼠新鲜肺组织进行HE染色,由肺切片能够观察到在对照组肺组织中存在多个肺转移灶且肿瘤异型性明显,肺转移灶数目与大小均明显高于DSF/Cu给药组,表明DSF/Cu能够抑制结直肠癌细胞在体内的转移。(3)DSF/Cu治疗结直肠癌的分子作用机制的探索:为进一步探究DSF/Cu抗结直肠癌的分子机制,对体外细胞以及体内瘤组织GNL3表达的影响研究证实了 DSF/Cu给药后可以抑制GNL3的表达,同时本课题还发现GNL3与多药耐药蛋白MRP1存在一定的共表达相关性。通过Western Blot与RT-PCR检测了 GNL3在Caco-2、HCT116、HT-29、LOVO、SW480五株结直肠癌细胞中均呈阳性表达,选取表达量最高的HCT116细胞建立了 GNL3敲低与过表达细胞系,通过细胞克隆、细胞划痕、Transwell、Western Blot和RT-PCR实验验证了 GNL3表达的高低会导致结直肠癌细胞增殖能力、迁移能力以及MRP1的表达发生相同趋势的改变,DSF/Cu干预GNL3过表达的HCT116(HCT116-GNL3-OV)细胞实验表明DSF/Cu可以拮抗细胞内GNL3升高带来的细胞增殖能力与迁移能力的加强。最后将HCT116-PLVX细胞和HCT116-GNL3-OV细胞接种至裸鼠皮下建立移植瘤模型,共设置四个实验组分别是HCT116-PLVX对照组、HCT116-PLVX+DSF/Cu 组、HCT116-GNL3-OV 组、HCT116-GNL3-OV+DSF/Cu 组,体内实验结果表明用DSF/Cu治疗能够抑制GNL3过表达所致的裸鼠体内肿瘤的生长,并通过Western Blot检测裸鼠瘤体组织中GNL3与MRP1蛋白的表达情况发现与体外细胞实验具有相同的趋势。综上所述,本课题通过体外细胞功能实验与体内动物模型的建立验证了 DSF/Cu能够影响结直肠癌细胞在体内外的增殖与转移能力,并通过构建HCT116-GNL3敲低与过表达细胞系BLZ945进一步探究selleck PLX-4720DSF/Cu发挥抗肿瘤活性的分子机制,实验结果证明DSF/Cu可以通过调控GNL3的表达发挥影响结直肠癌细胞增殖、迁移与耐药的作用。为后续双硫仑类化合物应用于结直肠癌的临床治疗以及开发以GNL3为特异性靶点的结直肠癌分子靶向治疗药物提供了研究基础。