背景动脉粥样硬化(AS)是一种由多种因素诱发的与年龄相关的慢性炎症性疾病,其确切的发病机制目前尚不清楚。目前,内皮损伤被认为是动脉粥样硬化的起始环节。研究表明,氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)可以促进血管内皮结构的损伤和功能障碍,是内皮损伤的主要因素之一,在动脉粥样硬化中发挥重要作用。丙泊酚是一种常用的静脉麻醉剂,被证明可以通过多种机制缓解内皮细胞功能障碍,但其是否减轻ox-LDL导致的内皮细胞损伤,目前尚不清楚。自噬在真核细胞中发挥关键的生理作用,在能量或营养GNE-140配制缺乏的情况下,自噬激活帮助细胞适应环境的变化,可防止细胞损伤。有研究显示,丙泊酚可增强自噬来增加内皮细胞迁移和血管生成,但其在ox-LDL诱导内皮细胞损伤中的作用及其具体机制,目前尚不清楚。PI3K是一种广泛分布于细胞质中的激酶,是细胞中重要的信号转导分子,可被激素、生长因子和细胞因子等多种细胞外信号激活,进而激活下游Akt。m TOR作为PI3K/Akt的关键下游信号,可被Akt磷酸化而激活,发挥负向调节自噬的作用。研究表明,PI3K/Akt/m TOR信号通路参与了AS时自噬的调控,此外有研究发现,丙泊酚可抑制心肌PI3K/Akt信号通路,但其是否通过PI3K/Akt/m TOR信号通路调控ox-LDL处理后内皮细胞的自噬,目前尚不清楚。综上,本研究推测:丙泊酚抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路,上调内皮细胞自噬,减轻ox-LDL诱导的内皮损伤,改善动脉粥样硬化。目的本研究分别使用ox-LDL诱导的血管内皮细胞与高脂饲料饲喂的ApoE~(/-)基因敲除小鼠作为模型,从体内体外研究丙泊酚对受损内皮细胞的作用以及抗动脉粥样硬化的分子机制。方法1.以0、10、20、50、100和150μg/m L ox-LDL处理HUVECs 24 h,以100μg/m L ox-LDL处理HUVECs 6、12、24beta-lactam antibiotics、48和72 h,以5、25和100μM浓度的丙泊酚联合100μg/m L ox-LDL,共同处理HUVECs。以CCK-8实验检测细胞增殖,以Annexin V/PI双染和流式细胞技术检测细胞凋亡,以LDH实验检测细胞损伤,以免疫印迹检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3、Cleaved Caspase3的表达,以Caspase3活性试剂盒检测凋亡相关蛋白Caspase3的活性变化。2.以100μg/m L ox-LDL处理HUVECs 6、12和24 h,并且以5、25和100μM浓度的丙泊酚联合100μg/m L ox-LDL,共同处理HUVECs,用免疫印迹检测自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II、p62和Beclin-1的表达,用电镜方法观察细胞内的自噬体。以100μg/m L ox-LDL处理HUVECs,用10 n M Rapmycin(自噬激活剂)或100 n M Bafilomycin A1(自噬抑制剂)干预细胞自噬,CCK-8实验检测细胞增殖,Annexin V/PI双染和流式细胞技术检测细胞凋亡,LDH实验检测细胞损伤,免疫印迹检测自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II和Beclin-1的表达。以100μM浓度的丙泊酚联合100μg/m L ox-LDL,共同处理HUVECs,用100 n M的自噬抑制剂Bafilomycin A1或Beclin-1 si RNA阻断细胞自噬,电镜方法观察细胞内的自噬体,CCK-8实验检测细胞增殖,Annexin V/PI双染和流式细胞技术检测细胞凋亡,免疫印迹检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3和Cleaved Caspase3的表达。3.以100μM浓度的丙泊酚联合100μg/m L ox-LDL,共同处理HUVECs,用20μM PI3K激活剂740Y-P增强细胞PI3K活性,用免疫印迹方法检测PI3K/Akt信号通路PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的蛋白表达,检测自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II、p62和Beclin-1的表达。4.选择ApoE~(-/-)基因敲除雄性小鼠,饲喂高脂饲料制作AS动物模型,腹腔注射75 mg/kg丙泊酚和22.4 mg/kg 740Y-P(PI3K/Akt/m TOR信号通路激活剂)对小鼠给药,以采集小鼠眼眶静脉丛血液与主动脉组织标本,血生化分析仪测定各组小鼠血脂含量(TG、TC、HDL-C、LDL-C);小鼠主动脉弓进行冰冻切片,行H&E及油红O染色,分别在电镜下与显微镜下观察小鼠主动脉病理变化MK-2206及主动脉斑块形成情况,用免疫印迹方法检测自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II、p62和Beclin-1的表达。结果1.丙泊酚改善ox-LDL损伤的HUVECs的增殖、凋亡、细胞损伤、凋亡通路指标不同浓度ox-LDL处理HUVECs24 h,随着ox-LDL浓度升高,HUVECs凋亡水平和细胞损伤逐渐升高,细胞生存率逐渐下降。以100μg/m L ox-LDL处理HUVECs不同时间,随着处理时间延长,HUVECs凋亡水平和细胞损伤逐渐升高,细胞生存率逐渐下降。100μM以下丙泊酚对HUVECs无明显毒性,并且显著改善100μg/m L ox-LDL处理的HUVECs的细胞生存率,降低细胞凋亡和细胞损伤,逐渐增强抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平,降低Cleaved Caspase3/Caspase3比值和促凋亡蛋白Bax表达水平,呈浓度-效应关系,降低HUVECs的Caspase3的活性。2.丙泊酚上调ox-LDL诱导的HUVECs自噬ox-LDL于24h时诱导HUVEC产生自噬,自噬激活剂Rapmycin进一步促进ox-LDL诱导的HUVECs自噬发生后,显著上调Beclin-1蛋白表达和LC3-II/I的比值,增加HUVECs的细胞存活率,降低细胞凋亡和损伤;相反,自噬抑制剂Bafilomycin A1阻断自噬发生后,显著下调Beclin-1蛋白表达和LC3-II/I的比值,降低HUVECs的细胞存活率,增加细胞凋亡和损伤。而Rapmycin或Bafilomycin A1不能使正常HUVECs细胞的自噬、增殖、凋亡和损伤产生显著影响,仅ox-LDL存在情况下,产生显著影响。丙泊酚可以进一步增强ox-LDL诱导的HUVECs的自噬水平,进一步上调Beclin-1蛋白表达和LC3-II/I比值,下调p62蛋白表达,增加自噬体数量,并呈现浓度-效应趋势。然而,100μM浓度以下丙泊酚不能刺激正常HUVECs的自噬发生,仅ox-LDL存在情况下,可上调Beclin-1蛋白表达和LC3-II/I比值。丙泊酚改善ox-LDL诱导的HUVECs的增殖、凋亡、细胞损伤、凋亡通路指标,然而,自噬抑制剂Bafilomycin A1和Beclin-1 si RNA阻断自噬后,降低了丙泊酚的HUVECs保护效应,表明丙泊酚对ox-LDL诱导的HUVECs损伤的保护作用是通过上调自噬而发挥的。3.丙泊酚抑制PI3K/Akt/m TOR通路介导自噬上调改善ox-LDL诱导的HUVECs采用丙泊酚和PI3K激活剂740Y-P共同预处理HUVECs,再加入ox-LDL处理HUVECs,发现ox-LDL上调p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平,激活PI3K/Akt信号通路活性,丙泊酚预处理显著抑制ox-LDL激活的PI3K/Akt信号通路活性,下调p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平,下调p-m TOR/m TOR比值和p62蛋白表达水平,上调LC3-II/I比值和Beclin-1蛋白表达水平,而740Y-P激活PI3K后,阻断丙泊酚抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路介导的HUVECs自噬发生,上调p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平,上调p-m TOR/m TOR比值和p62蛋白表达水平,下调LC3 II/I比值和Beclin-1蛋白表达水平。4.丙泊酚提高高脂饲养ApoE~(-/-)小鼠主动脉自噬水平体内实验,验证丙泊酚改善高脂饲养ApoE~(-/-)小鼠主动脉的粥样硬化病理形态及减少斑块形成的面积,同时上调主动脉Beclin-1蛋白水平、LC3-II/I比值,降低p62蛋白水平,而PI3K激活剂740Y-P共同处理组,由于激活ApoE~(-/-)小鼠的PI3K,阻断了丙泊酚的主动脉粥样硬化病理改善作用和自噬增强作用,下调主动脉Beclin-1蛋白水平、LC3-II/I比值,增加p62蛋白水平。结论本研究表明丙泊酚通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路,增强自噬,减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤和凋亡。