鸭(Anas platyrhynchos)是世界范围内动物性蛋白(肉和蛋)生产的主要禽类之一,在亚洲占有尤其重要的地位。中国是重要的肉鸭生产消费国,且鸭肉产量占世界鸭肉总产量的一半以上。近些年来,针对肉鸭生长速度和饲料转化率的选育提高,显著加快了肌肉的生长速度和产量。鸭胚的生理功能已经得到充分发挥,可以被用于早期肌肉生长发育的分子调控机制研究。而胚蛋注射(In ovo injection,IOI)作为一种简便易行的技术,被广泛用来研究具有不同功能调控作用的物质(如氨基酸、碳水化合物等营养成分、益生菌等),如何影响鸭胚的生长发育和代谢调控,以及其具体分子机制是近期的一个研究热点。支链氨基酸(Branched Chain Amino Acids,BCAA)对家禽生长、发育和健康至关重要。膳食中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的失衡(某个BCAA的供应过量或不足)是对家禽生长率产生负面影响的主要原因之一。BCAA不平衡会导致BCAA的拮抗作用,影响机体的免疫功能。缬氨酸缺乏会抑制生长性能,导致羽毛和腿部畸形。一系列实验证明BCAA影响肉鸡的生长性能,特别是肌肉产量。肌肉生长发育主要通过AKT/m TOR途径调节。然而,过量缬氨酸对肝脏和肌肉生长的详细分子机制尚不清楚。本研究旨在:(1)比较胚蛋添加不同浓度缬氨酸对鸭胚生长发育和脂质沉积的影响;(2)通过对鸭胚胸肌进行转录组和代谢组测序筛选关键基因和标志代谢物,探明其分子机制。1.比较不同缬氨酸添加对鸭胚生长发育和脂质沉积的影响通过种蛋孵化、注射及组织采集实验比较不同浓度缬氨酸对各个重要组织重量或长度的影响,结果显示,两性的胸肌重量、雄性胰腺重量和雌性性腺(卵巢)长度均显著增加。肝脏、腿肌、心脏、脾脏、雌性胰腺、腹脂重量和十二指肠、空肠、回肠、雄性性腺长度无显著性差异。通过对出雏时间统BioMark HD microfluidic system计,观察到缬氨酸注射组显著缩短了鸭胚的孵化时间,且浓度为2%的缬氨酸注射组孵化时间最短。注射实验完成后,每隔三天对各组鸭胚分雌雄采血并分离血清,发现雄性和雌性胚胎血清IGF-1水平不同,且不同的缬氨酸浓度对其有显著影响。同时,注射较高浓度的缬氨酸可能会增加不同胚龄血清中IGF-1水平。根据前期实验结果,选择E22、E25、E28胚龄2%缬氨酸组和对照组雌雄鸭胚肝脏和胸肌组织进行石蜡切片及HE染色,并对染色后切片进行定量分析,结果发现对于肝脏补充2%缬氨酸显著增加了三个时间点雏鸭的脂滴数量,然而缬氨酸对脂滴的平均面积没有影响,对于胸肌来说2%缬氨酸处理可以减少肌肉纤维的比例,但增加结缔组织的比例,尤其是E25。定量分析发现,肌纤维直径显著增大,但肌纤维数量显著减少。为进一步研究缬氨酸对生长发育和脂质沉积的作用及其调控机制,选择与IGF1相关的生长发育和脂质沉积相关基因,利用实时荧光定量分析技术观察各基因在出壳第一天鸭胚肝脏和胸肌组织中的表达情况。试验表明此网站蛋内注射缬氨酸可以抑制鸭胸肌的生长和发育,提升肝脏脂滴数量,降低胸肌肌纤维数量和直径。此外,肌肉抑制素(MSTN)显著增加了其在雄性胸肌中的表达水平。2.胸肌转录组和代谢组测序分析其具体分子机制随机抽取同批孵化E22雄性鸭胚胸肌组织,其中2%缬氨酸组和对照组各六只,分别进行转录组和代谢组测序。利用转录组和代谢组测序筛选差异基因及鉴定标志性差异代谢物,并通过联合分析来探索缬氨酸调控鸭胚胸肌生长发育的相关分子信号通路及其机制。对Val组与Con组转录组测序数据进行比较,统计筛选后发现一共存在267个表达有显著性差异的基因,包含137个上调基因和130个下调基因。为了探索DEGs的生物学功能,对两个处理组中所有差异表达的基因进行了GO功能富集分析,发现其在脂肪合成、自噬调节等相关生物学进程显著富集;KEEG通路分析发现selleck Dolutegravir,DEGs参与m TOR、AMPK和胰岛素等信号通路来调节鸭胚的生长发育。为了能够更好确定RNA-seq数据的可靠性,筛选了11个有显著特点的基因对同批次的鸭胸肌进行q PCR验证,结果发现和之前的转录组测序的数据基本相同,证明了RNA-seq结果是可靠的。Val组与Con组代谢组测序发现共有14个差异代谢物,包含5个上调差异代谢物和9个下调差异代谢物。在这些差异代谢物中,不仅含有有机酸和相关衍生物,同时还包括氨基酸、核苷酸等物质。通过利用代谢通路实验分析,还包括氨基酸代谢、生物碱合成物以及脂肪酸代谢、磷酸转移酶等物质,这些物质也在鸭胸肌发挥调节等作用。通过酶联免疫吸附实验对两个与肌肉生长发育相关的标志性差异代谢物:氨基己二酸和1-甲基组氨酸进行验证,统计计算后发现与测序结论一致,说明代谢组测序结果准确可靠。此外也进行分组比对,将Val与Con两组差异表达基因和代谢物进行相关性分析,构建相关性聚类热图。研究发现这两组的差异代谢物以及高表达的前45个差异基因相关性较高,也反映了降低鸭胚胸肌重量的差异代谢物变化跟差异表达基因的变化有关。综上所述,蛋内注射缬氨酸可以抑制鸭胸肌的生长和发育,缩短孵化时间,影响肝脏中的脂滴数量以及胸肌中肌纤维的数量和直径。缬氨酸添加可以影响鸭胚胸肌组织的胰岛素和自噬等相关信号通路,以及调控鸭胚肝脏和肌肉组织。研究结果为深入探索缬氨酸影响鸭胚生长发育奠定了基础,为进一步研究BCAA失衡对家禽生产的影响提供了新的见解。