双生病毒是一大类的植物病毒,其基因组为单链环状DNA,20世纪出现的双生病毒新种引起的严重流行病,对棉花、谷物、豆类和番茄等作物的生产造成了严重的影响。随着高通量测序技术的发展,研究人员从柑橘、桑树、苹果等木本植物也陆续检测到了新的双生病毒种类。柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)是从柑橘上分离的一种单组份的DNA病毒,为双生病毒科的新属Citlodavirus,给我国柑橘产业造成了巨大的潜在风险。双生病毒编码的一些蛋白对病毒与宿主植物的相互作用至关重要,然而目前对CCDa V的研究主要集中在分离鉴定和基因组测序,而致病机理尚不明确。本文在筛选、鉴定CCDa V致病相关蛋白的基础上,针对转录因子WRKY1对致病相关蛋白在本生烟上引起的超敏反应(HR)型细胞死亡的调控反应进行了初步研究。主要结果如下:1.CCDa V致病相关蛋白的筛选与鉴定为了筛选鉴定CCDa V的致病相关蛋白,本研究将CCDa V编码6个蛋白的全长序列构建到含有GFP的(Potato virus X(PVX)载体中,症状观察表明在浸润第5天时,仅有接种RepA-GFP和Rep-GFP的本生烟出现叶片坏死症状。进一步通过3,3’二氨基苯胺(DAB)实验和电解质渗漏实验,结果表明RepA和Rep可以诱导H_2O_2积累,并提高离子渗透率,由此证实CCDa V编码的蛋白可引起本生烟产生HR型细胞坏死。另外本研究通过使用PVX载体表达RepA和Rep,排除了GFP可能对RepA和Rep诱导本生烟叶片坏死的影响。通过酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)证明,PVX含量的差异与RepA在本生烟上引起HR型细胞坏死症状无关。进一步将CCDa V 6个ORFs构建到双元重组载体p Nm GFPer中,发现表达RepA和Rep的在本生烟上均出现局部坏死症状。综上所述,CCDa V的6个ORFs中的Rep和RepA为致病相关蛋白,且可诱导本生烟出现HR型细胞坏死反应。2.RepA诱导超敏反应(HR)型细胞死亡关键区域的鉴定为了探索RepA中诱导的本生烟HR型细胞坏死的关键结构域,本研究利用生物信息学分析RepA的序列和结构域,构建了8个RepA的缺失突变体(RepA~(DM1-DM8)),并利用农杆菌介导在本生烟中瞬时表达。结果表明,RepA的滚环复制基序(aa16-20,aa57-63和aa103-108)是诱导本生烟HR反应所必需的。另外,亚细胞定位实验结果表明,RepA和含有滚环复制基序的缺失突变体(RepA~(DM1)、RepA~(DM7-DM8))均定位于本生烟表皮细胞核中,而不含有滚环复制基序的缺失突变体(RepA~(DM2-DM6))主要定位于细胞质中。将定位结果和症状联合起来进行分析,推测RepA的核定位可能与其诱导的本生烟HR反应有关。此外PSORT在线软件预测未发现与核定位信号序列一致的碱性氨基酸,提示存在非典型核定此网站位信号。3.RepA诱导的植物抗性反应为了进一步确定RepA诱导的HR和本生烟免疫应答之间的关联,本研究通过RT-q PCR检测发现,瞬时表达RepA的本生烟中对水杨酸(Salicylic acid,SA),茉莉酸(Jasmonic acid,JA)通路关键基因(Nb PR1,Nb PR2,Nb PR3,Nb PR4和Nb PR5,Nb NPR1)的表达水平进行测定显著升高,但是乙烯(Ethylene,ET)通路中Nb ERF1的表达量无显著变化。为了探究RepA诱导的HR反应是否能激发植物selleck CL 318952对其它种类病毒的抗性,本研究将番茄黄化曲叶病毒(Liver immune enzymesTomato yellow leaf curl virus,TYLCV)侵染性克隆分别与含有表达35s-GFP或RepA-GFP的农杆菌共浸润到本生烟中,结果显示RepA可以减轻TYLCV引起的本生烟叶片卷曲症状。为了验证病毒编码蛋白是否可以抑制HR反应,本研究将CCDa V编码的其他蛋白(V1、V2、V3、V4和Rep)与RepA蛋白在本生烟上共同表达,结果显示其他CCDa V蛋白都不能抑制RepA诱导的HR型细胞死亡反应。4.WRKY1对RepA诱导的HR型细胞死亡的调控作用为了评估WRKY1,NPR1,AOX,COI,CTR,NDR1,RAR1,NTF6和MEK2是否参与了RepA诱导的HR型细胞死亡反应,利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)载体在本生烟中沉默了信号级联组件,在沉默第9天时,将RepA-GFP接种在沉默本生烟植株中,并在接种的第3天时观察表型,结果发现成功沉默WRKY1后接种RepA的本生烟无坏死症状出现,用RT-q PCR检测浸润RepA-GFP的本生烟叶片中Nb WRKY1的表达水平,结果显示RepA-GFP的表达上调了Nb WRKY1表达。另外,本研究通过酵母双杂,萤火虫荧光素酶互补成像(firefly luciferase complementation imaging,LCI)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,Bi FC)实验发现RepA与WRKY1没有相互作用。