目的:最新的肿瘤登记数据显示,我国胃癌发病和死亡人数均居恶性肿瘤的第3位。由于胃癌起病隐匿,我国确诊的胃癌患者90%已是进展期,因此我国胃癌的5年生存率仅为35.1%。胃癌是一种高异质性肿瘤,临床上缺乏有效的生物标志物进行疗效预测和长期预后评估。G蛋白信号调节因子(Regulator of G-protein signaling,RGS)家族是G蛋白偶联受体的调节因子家族,既往研究发现其家族成员的异常表达既可通过影响肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性功能直接参与多种肿瘤的进展并导致患者的不良预后,也可影响肿瘤微环境中免疫细胞的趋化性和浸润程度间接参与肿瘤的进展并影响预后。但RGS家族是否在胃癌组织中异常表达且与胃癌的临床特征和不良长期预后相关,及其是否可能通过免疫途径发挥调控作用,仍需进一步阐明。本研究首先利用TCGA数据,筛选并确定在胃癌组织中异常表达且与胃癌临床特征和长期预后密切相关的RGS家族成员,并利用本项目组的胃癌队列进行验证;其次利用TCGA数据和胃癌队列探索并验证筛选后确定的RGS家族成员与肿瘤微环境中免疫细胞浸润的关系;最后利用细胞学实验明确筛选出的RGS家族成员对胃癌细胞以及免疫细胞的潜在调控机制。方法:1.基于TCGA数据,在mRNA水平上,比较RGS家族各成员在胃癌组织和癌旁对照组织中的表达水平,并探索RGS家族各成员与胃癌临床特征和长期预后的关系,筛选在胃癌中异常表达且与胃癌临床特征和长期预后密切相关的RGS家族成员(RGSx)。2.胃癌队列的研究对象来自2011-2016年在吉林大学第一医院行胃癌根治术的胃癌患者,知情同意后收集组织标本、人口学资料和临床病理资料,并对患者进行定期随访。利用免疫组织化学法确定RGSx蛋白在胃癌组织和配对的癌旁对照组织中的表达水平。进一步利用c~2检验、Fisher’s精确检验以及生存分析验证在蛋白表达水平上,RGSx与胃癌临床特征和长期预后的关系。3.基于TCGA数据,比较RGSx最低表达组(四分位数Q1)和最高表达组(四分位数Q4)患者的转录组数据,筛选出差异基因,并将差异基因进行GO和KEGG富集分析,预测RGSx可能发挥的功能及潜在的调控通路。利用Estimate算法计算胃癌组织的免疫微环境评分,EPIC算法估算免疫细胞浸润程度。计算Spearman相关系数用于探索RGSx表达与免疫微环境评分、免疫细胞浸润程度及免疫细胞标志物表达水平的相关性。4.基于胃癌队列,分析RGSx蛋白与免疫细胞浸润的相关性。进一步依托TCGA数据和胃癌队列,利用c~2检验、Fisher’s精确检验以及生存分析探索RGSx表达联合免疫细胞浸润水平与胃癌临床特征和长期预后的关系。5.通过qRT-PCR和Western-blot实验,比较胃癌细胞系和永生化胃黏膜上皮细胞中RGSx的表达水平。分别构建RGSx敲减和过表达的胃癌细胞系,通过CCK8实验、流式实验和transwell实验探索RGSx对胃癌细胞系的增殖、周期和凋亡、迁移和侵袭能力的调控作用。6.通过qRT-PCR和ELISA实验筛选KEGG通路富集提示的受RGSx调控的靶基因。构建胃癌细胞和免疫细胞的共培养体系,利用transwell实验、qRT-PCR和流式实验探索不同RGSx表达水平的胃癌细胞对免疫细胞的募集作用和对细胞极性的影响,并通过营救实验证实RGSx对免疫细胞的影响是通过调控靶基因而实现的;最后基于共培养体系探索免疫细胞对不同RGSx表达水平的胃癌细胞的功能的影响。结果:1.RGS家族中,RGS1在胃癌组织中高表达且与更高的胃癌恶性程度和不良长期预后相关TCGA数据中包含胃癌患者373人,排除首次失访即失访和围手术期死亡的患者后,共333例患者纳入后续生存分析,中位随访时间为25.1个月,142例(42.0%)患者发生死亡。TCGA数据中观察到RGS1、RGS2、RGS3、RGS5、RGS9、RGS11、RGS13、RGS16和RGS19在胃癌组织中异常表达;RGS1,RGS2和RGS18与胃癌进展指标相关;RGS1、RGS4和RGS20与胃癌患者长期预后独立相关。RGS家族中在胃癌组织中异常表达且与胃癌恶性程度和不良长期预后均密切相关的成员为RGS1,因此我们将RGS1作为本研究目的基因,并进一步在胃癌队列中验证RGS1在胃癌组织中的表达水平且与胃癌临床特征和长期预后的关系。胃癌队列中共纳入了375例符合纳入排除标准的胃癌患者,排除首次随访即失访2例患者和围手术期死亡的2例患者后,共371例患者纳入后续生存分析,中位随访时间为100.6个月,244例(65.8%)患者发生死亡。在胃癌队列中,免疫组化染色显示,RGS1蛋白在细胞膜和细胞质中表达。胃癌组织中RGS1的高表达的比例高于癌旁对照组织(P<0.001);RGS1高表达与更大的肿瘤直径(P=0.005)和神经束膜浸润阳性(P=0.043)相关。多变量调整TNM分期等可能影响胃癌总生存的因素后,仍发现RGS1高表达是胃癌患者总生存期缩短的独立危险因素(HR:1.38,95%CI:1.02-1.85)。2.RGS1表达与M2巨噬细胞浸润相关,两者联合与胃癌更高的胃癌恶性程度和更短的总生存期相关TCGA数据显示,相对于RGS1低表达组,在RGS1高表达组有689个基因表达上调,36个基因表达下调。差异表达基因的GO功能分析集中在免疫系统过程、免疫反应过程,提示RGS1可能通过免疫调控发挥功能。免疫的相关性分析显示,RGS1表达水平与估计评分(r_s=0.71,P<0.001)、免疫浸润评分(r_s=0.71,P<0.001)和基质评分(r_s=0.59,P<0.001)呈正相selleck MCC950关;RGS1表达水平与巨噬细胞浸润程度的相关性最强(r_s=0.63,P<0.001),进一步分析显示在m RNA表达水平上RGS1表达与M2巨噬细胞的经典标志物CD163、CD206和VSIG4表达均有较高的相关性(r_s分别为0.62、0.57、0.58,P均<0.05)。在胃癌队列中,在蛋白表达水平上RGS1表达与CD163、CD206和VSIG4表达也呈现了较强相关性(r分别为0.44、0.36、0.39,P均<0.05)。进一步利用TCGA数据和胃癌队列分析了RGS1表达联合M2巨噬细胞浸润与胃癌临床特征和长期预后的相关性。TCGA结果显示,在m RNA表达水平,相对于RGS1~-&CD163~-、RGS1~-&CD206~-、RGS1~-&VSIG4~-,在RGS1~+&CD163~+、RGS1~+&CD206~+、RGS1~+&VSIG4~+组中高肿瘤级别的胃癌患者的比例均较高(P均<0.05);多因素调整后,RGS1~+&CD163~+、RGS1~+&CD206~+和RGS1~+&VSIG4~+组患者的死亡风险有升高的趋势。胃癌队列的结果显示,在蛋白表达水平上,RGS1~+&CD163~+、RGS1~+&CD206~+和RGS1~+&VSIG4~+组肿瘤直径>5cm的患者比例均更高(P均<0.05);多因素调整后,RGS1~+&CD163~+、RGS1~+&CD206~+、RGS1~+&VSIG4~+组胃癌患者发生死亡的风险均显著增高(HR分别为1.73,95%CI:1.24-2.42;1.67,95%CI:1.19-2.36;1.67,95%CI:1.18-2.38)。3.RGS1表达促进胃癌细胞的增殖、周期、迁移和侵袭,抑制凋亡qRT-PCR和Western-blot结果显示,与永生化胃黏膜上皮细胞GES-1相比,RGS1 m RNA和蛋白在胃癌细胞系MKN28、BGC823、AGS和SGC7901中的表达升高。选择RGS1表达相对较高的AGS和SGC7901胃癌细胞系构建RGS1敲减细胞系,选择RGS1表达相对较低的MKN28和BGC823胃癌细胞系构建RGS1过表达细胞系。相对于对照组,在RGS1敲减的AGS和SGC7901胃癌细胞系中,细胞增殖能力降低,细胞的周期阻滞在G1/S期,细胞周期被抑制,细胞凋亡的比例升高,穿过transwell小室以及含基质胶的小室的细胞减少,细胞的迁移和侵袭能力降低;相反地,相对于对照组,在RGS1过表达的MKN28和BGC823胃癌细胞系中,细胞增殖能力升高,细胞周期处于G2期的比例增加,细胞周期被influence of mass media促进,细胞凋亡的比例降低,穿过transwell小室以及含基质胶的小室的细胞增多,细胞迁移和侵袭能力升高。4.RGS1通过诱导趋化因子CCL4表达进一步促进巨噬细胞的招募和极化差异表达基因的KEGG富集分析GW-572016 molecular weight提示RGS1可能参与趋化因子信号通路调控。qRT-PCR和ELISA结果显示,在RGS1敲减的胃癌细胞及其培养基中,趋化因子CCL4表达降低;在RGS1过表达的胃癌细胞及其培养基中,CCL4表达升高。在共培养体系中,采用不同RGS1表达水平的胃癌细胞的培养基培养M0巨噬细胞,相对于对照组,RGS1敲减的胃癌细胞培养基培养M0巨噬细胞后,穿过transwell小室的M0巨噬细胞细胞减少,M0巨噬细胞中CD163的m RNA表达量以及CD163阳性的M0巨噬细胞数量降低(P<0.05),RGS1敲减的胃癌细胞对M0巨噬细胞的招募和极化作用减弱;向RGS1敲减的胃癌细胞培养基中添加CCL4重组蛋白后,相对于未添加CCL4组,穿过transwell小室的M0巨噬细胞细胞增多,CD163的m RNA表达量以及CD163阳性的巨噬细胞数量升高(P<0.05),CCL4可以部分恢复RGS1敲减胃癌细胞对M0巨噬细胞的招募和极化的抑制作用;RGS1过表达的胃癌细胞培养基培养M0巨噬细胞后,穿过transwell小室的M0巨噬细胞细胞增多,CD163的m RNA表达量以及CD163阳性的巨噬细胞数量升高(P<0.05),RGS1过表达的胃癌细胞可招募和极化M0巨噬细胞;同样的,在RGS1过表达的胃癌细胞培养基中添加CCL4后,观察到CCL4可以进一步提升RGS1过表达胃癌细胞对M0的招募和极化的促进作用。5.RGS1与M2巨噬细胞联合促进胃癌细胞的生长、迁移和侵袭用M2巨噬细胞的条件培养基(M2 Macrophages conditional medium,M2 CM)培养RGS1敲减或过表达的胃癌细胞后,细胞功能结果显示,与未添加M2 CM的RGS1敲减的胃癌细胞相比,添加M2 CM后,RGS1敲减的胃癌细胞的增殖能力升高,细胞周期处于G2期的比例增加,细胞周期被促进,细胞凋亡的比例降低,穿过transwell小室以及含基质胶的小室的细胞增多,细胞迁移和侵袭能力升高。与未添加M2 CM的RGS1过表达的胃癌细胞相比,添加M2 CM后,进一步增加了RGS1过表达后对胃癌细胞增殖、周期、迁移和侵袭的促进作用,进一步降低了RGS1过表达后对胃癌细胞的凋亡的抑制作用。结论:1.RGS家族中,RGS1在胃癌组织中高表达,RGS1高表达与胃癌恶性程度和患者的不良长期预后正相关;RGS1有可能作为胃癌恶性程度和长期预后评估的生物标志物。2.RGS1高表达的胃癌组织中有较高水平的M2巨噬细胞浸润,RGS1表达联合M2巨噬细胞浸润与胃癌更高的恶性程度和更短的总生存期相关。3.RGS1在胃癌细胞中表达水平升高,RGS1表达可促进胃癌细胞的增殖、周期、迁移和侵袭,抑制胃癌细胞的凋亡。4.RGS1可通过诱导趋化因子CCL4的表达,促进巨噬细胞的招募和向M2型巨噬细胞的极化,RGS1表达和M2噬细胞浸润联合促进胃癌细胞的增殖、周期、迁移和侵袭,抑制胃癌细胞的凋亡。