研究背景:卵巢癌(Ovarian carcinoma,OV)是死亡率最高的妇科恶性肿瘤之一。尽管在过去40年中卵巢癌的生存率有所提高,但仍有五分之三的妇女在确诊后的5年内死亡。因此有必要探索与卵巢癌患者预后和治疗效果相关的新因素。肿瘤微环境(tDecitabine试剂umor microen vironment,TME)在研究癌症的临床结局与药物反应过程中,发挥了重要作用。免疫细胞作为重要组成部分,对肿瘤的发生发展和抗肿瘤治疗的疗效有重要影响。TME是一个有利于微生物生长的生态位,最近的研究证明微生物存在于包括卵巢癌在内的大多数人类肿瘤中。微生物不仅可以作为直接致癌物促进肿瘤发生,还通过多种方式影响癌症治疗效果。瘤内微生物与卵巢癌的TME和预后的关系尚不清楚。此外,与卵巢癌的TME和预后相Ceralasertib半抑制浓度关的微生物功能也有巨大的探索价值。本研究基于癌症基因组图谱(The Cancer GenoAlternative and complementary medicineme Atlas,TCGA)的OV转录组测序数据探索肿瘤内微生物与宿主基因表达之间的相互作用。通过基因集变异分析(Gene Set Variation Analysis,GSVA)和聚类分析对肿瘤进行分型,并描述不同亚型的特点;从转录组数据中提取非人类的序列,并利用这些序列进行微生物比对;比较亚型间微生物的组成差异;筛选与生存预后相关的微生物;进一步分析肿瘤内微生物与TME的关联,利用细胞实验验证微生物与抗肿瘤免疫的关系。材料与方法:本研究纳入TCGA-OV项目中373份未经治疗的原发肿瘤样本,下载其原始转录组测序数据、基因表达矩阵、临床和生存信息、T细胞受体/B细胞受体多样性、肿瘤纯度和新抗原负荷数据;从Bagaev等人的研究中收集TME相关的特征基因集。通过基因表达矩阵分析OV患者的瘤内免疫状态,并对其进行聚类分型,进一步识别不同亚型的肿瘤免疫微环境的特点,包括免疫细胞、肿瘤突变负荷(Tumor Mutational Burden,TMB)等;通过差异表达分析识别组间差异表达基因,基于京都基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和基因本体论(Gene Ontology,GO)数据库进行基因富集分析。对于原始的转录组测序数据进行序列过滤、质控、微生物比对、污染物识别及去污分析;对获得的微生物组成数据通过α和β多样性分析、线性判别分析效应大小(Linear discriminant analysis effect size,LEfSe)分析探索不同免疫亚型间微生物组成的差异;使用MetagenoNets平台进行CCLasso分析,识别不同亚型的微生物互作网络及核心微生物;使用单变量Cox比例风险分析筛选与生存预后相关的微生物标志物,利用Lasso-penalized Cox分析进一步挑选卵巢癌生存预后的标志微生物;基于Spearman秩相关分析探索预后相关微生物和肿瘤免疫微环境的关系。随后,本研究基于Acinetobacter seifertii与ID8小鼠卵巢癌细胞和小鼠腹腔巨噬细胞共培养体系对上述数据分析结果进行实验验证。设计并比较6个实验组:1)Acinetobacterseifertii组(As-10);2)Acinetobacter seifertii处理的ID8细胞组(ID8-As-10-cell);3)Acinetobacter seifertii处理的 ID8 细胞条件培养基(CM)组(ID8-As-10-CM);4)未处理的ID8细胞组(ID8-cell);5)未处理的ID8细胞的CM组(ID8-CM)和6)DMEM培养基组。使用定量反转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)分析Acinetobacter seifertii和ID8细胞对巨噬细胞分化的影响,使用Transwell迁移实验分析Acinetobacter seifertii和ID8细胞对巨噬细胞迁移能力的影响。研究结果:本研究共纳入TCGA中373份未经治疗的卵巢癌患者的原发肿瘤样本的转录组测序数据及其对应的临床和生存信息,从Bagaev等人的研究中获得29个描述肿瘤微环境的特征基因集。基于GSVA和聚类分析将卵巢癌分为免疫富集型和免疫缺失型,人口学和临床指标在两种亚型间无显著差异。与免疫缺失型相比,免疫富集型的总生存时间(Overall Survival,OS)(P=0.009)、无进展间隔期(Progression-Free Interval,PFI)(P=0.032)、疾病特异性生存期(Disease-Specific Survival,DSS)(P=0.01)和无疾病 间隔期(Disease-Free Interval,DFI)(P=0.004)显著延长。转录组分析结果表明免疫富集型呈现高免疫状态,TMB以及ID8+T细胞等免疫细胞浸润显著增加。组间差异表达基因显著富集于免疫激活、调节和免疫疾病相关的通路。通过对原始测序序列过滤、质控、微生物比对后共获得3040个种和871个属,经过污染物识别及去污后,共保留2526个种和855个属,有1 7%的微生物被识别为污染物并从下游分析中剔除。微生物组β多样性和CClasso分析发现免疫富集型和免疫缺失型的肿瘤内微生物组成存在显著差异,LEfSe分析发现以Pseudomonas为主的58个菌种在免疫缺失型显著富集,11个菌种在免疫富集型显著富集。微生物功能分析显示,免疫缺失型中的牛磺酸和次牛磺酸代谢(map00430)、PI3K-Akt信号通路(map04151)和磷脂酰肌醇信号系统(map04070)等微生物功能基因显著上调。单变量Cox比例风险分析共识别了 736个与OS、PFI、DSS或DFI显著相关的微生物(P<0.05),其中193个物种与OS有关。进一步经过Lasso-penalized Cox回归分析筛选了 32个预后微生物。相关性分析结果表明,有5种免疫细胞与7个微生物物种显著相关(P<0.05)。其中M1巨噬细胞与5种预后相关微生物显著相关(P<0.05),包括与2种保护因素(Achromobacter deleyi和Microcella alkiliile)成正相关,与3种危险因素(Devosia sp.LEGU1、Ancylobacter pratisalsi 和 Acinetobacter seifertii)成负相关。生存分析表明M1巨噬细胞是OV患者生存的保护性因素(P<0.05,HR<1),且在低风险组的肿瘤组织中浸润增加。因此M1巨噬细胞被识别为连接瘤内微生物与卵巢癌生存预后的关键细胞。RT-qPCR实验结果表明,与未处理的ID8细胞相比,用Acinetobacter seifertii处理的各组中,巨噬细胞的M1分化信号大幅上调。Transwell细胞迁移实验结果表明Acinetobacter seifertii处理后,尤其是ID8-As-10-cell组,巨噬细胞的迁移能力显著下降(P<0.05)。研究结论:本研究将OV分为免疫富集型和免疫缺失型,前者与生存时间延长显著相关。微生物组分析显示,不同亚型的瘤内微生物组成结构不同。我们还进一步筛选了 32个预后标志微生物,发现瘤内微生物与OV预后显著相关,并与OV的免疫状态显著相关。尤其M1巨噬细胞与瘤内微生物关系密切,且M1巨噬细胞与Acinetobacter seifertii呈负相关,细胞实验证明Acinetobacter seifertii可以通过抑制巨噬细胞的迁移能力影响其肿瘤内浸润。