全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate,PFOS)是一种典型的持久性有机污染物,当前已被列为全球应高度重视的10种工业化学品污染物之一,其对于生态环境和人类健康构成了一定的威胁。PFOS进入人体内后主要通过肝肠循环积聚在肾脏和肝脏中,肾脏是PFOS的主要排泄器官,但PFOS对肾脏上皮细胞损伤及其损伤的机制尚不清楚。已有研究表明,PFOS暴露可打破机体内的氧化和抗氧化平衡,而且PFOS在体内外可抑制抗氧化酶而诱发氧化应激损伤,PFOS还可导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERSCompound C分子量)的发生。铁死亡的发生与ROS和脂质过氧化关系密切,ERS在铁死亡和其他类型的细胞死亡之间的相互作用中起重要作用。但是尚不清楚ERS是否在PFOS所致的肾小管上皮细胞的损伤机制中发挥作用以及在PFOS所致的铁死亡中所发挥的作用。目的:明确PFOS对于人肾小管上皮细胞(human kidney-2,HK-2)的损伤作用,并探讨铁死亡和内质网应激在PFOS所致HK-2细胞损伤中的作用及机制,为探究PFOS的毒性及防治其健康损害提供科学依据。方法:用含有10%胎牛血清与1%双抗的MEM培养液进行体外培养HK-2人肾小管上皮细胞。生长状态良好且密度长至70%～80%时,进行后续实验。给予不同剂量的PFOS培养6 h、12 h和24 h,采用CCK-8法检测细胞存活率,确定后续实验PFOS的染毒剂量及染毒时间。给予不同浓度的Fer-1预处理2h后,再给予PFOS培养12 h,采用CCK-8法检测,确定本实验的Fer-1使用浓度。给予不同浓度的4-PBA预处理2 h后,再给予PFOS培养12 h,采用CCK-8法检测,确定本实验的4-PBA使用浓度。探索涉及铁死亡相关指标及其机制部分的分组为DMSO组(使用含0.1%DMSO的完全培养液进行培养12 h,Vascular graft infection其余不作处理)、PFOS组(给予200 μM浓度的PFOS处理12 h)、PFOS+Fer-1组(给予1 μM的Fer-1预处理2小时,给予200 μM浓度的PFOS处理12 h)。探索涉及内质网应激相关指标及其机制部分的分组为DMSO组(使用含0.1%DMSO的完全培养液进行培养12 h,其余不作处理)、PFOS组(给予200 μM浓度的PFOS处理12 h)、PFOS+4-PBA组(给予2 mM的4-PBA预处理2小时,给予200 μM浓度的PFOS处理12 h)。采用流式细胞术和DCFH-DA荧光探针染色检测各组细胞中ROS的产生水平;采用ELISA试剂盒检测各组细胞中GPX4的浓度;使用微量法试剂盒检测总铁离子、GSH、MDA的含量;采用Western Blot法检测铁死亡相关蛋白(GPX4、ACSL4、FTH1、COX-2)、抗氧化相关蛋白(P53、HO-1)、凋亡相关蛋白(Bax、Caspase12、Caspase3)、内质网应激相关蛋白(GRP78、IRE1、PERK、ATF6)和肾损伤相关蛋白(KIM-1)的表达。利用IBM SPSS 24.0软件进行统计分析,计量资料用x±s表示。采用方差分析法进行多组间的比较,LSD法进行组间两两比较。当P<0.05时,被认为有统计学差异。使用GraphPad Prism 8.0.2进行相关图片制作。结果:1.染毒剂量的确定使用CCK-8法检测PFOS、Fer-1和4-PBA对细胞存活率的影响,通过对实验数据的分析,我们选择培养时间12 h、浓度为200 μM的PFOS为本实验PFOS的处理浓度;选择1 μM作为Fer-1后续实验的浓度;选择2 mM作为4-PBA后续实验的浓度。2.各组细胞ROS的产生情况与DMSO组相比,PFOS组细胞内的ROS产生显著升高(P<0.05);与PFOS组相比,PFOS+Fer-1组的ROS产生显著降低(P<0.05)。与DMSO组相比,PFOS组的ROS荧光强度显著升高(P<0.05);与PFOS组相比,PFOS+Fer-1组的ROS荧光强度显著降低(P<0.05)。3.HK-2细胞中铁死亡相关指标表达水平与DMSO组相比,PFOS组的ACSL4和COX-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),GPX4和FTH1蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与PFOS组相比,PFOS+Fer-1组的ACSL4和COX-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05),FTH1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与DMSO组相比,PFOS组细胞中的GPX4含量显著降低(P<0.05);与PFOS组相比,PFOS+Fer-1组细胞中的GPX4含量显著升高(P<0.05)。与DMSO组相比,PFOS组的铁离子含量显著升高(P<0.05);与PFOS组相比,PFOS+Fer-1组的铁离子含量显著降低(P<0.05)。4.各组细胞中脂质过氧化水平与DMSO组比较,PFOS组细胞的GSH含量显著降低(P<0.05);与PFOS组比较,PFOS+Fer-1组细胞的GSH含量显著升高(P<0.05)。与DMSO组比较,PFOS组细胞的MDA含量显著升高(P<0.05);与PFOS组比较,PFOS+Fer-1组细胞的MDA含量显著降低(P<0.05)。5.HK-2细胞内抗氧化相关蛋白表达水平与DMSO组相比,PFOS组P53蛋白表达水平显著升高(P<0.05),HO-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与PFOS组相比,PFOS+Fer-1组的P53蛋白表达显著降低(P<0.05),HO-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。6.HK-2细胞凋亡水平与DMSO组相比,PFOS组的荧光强度显著升高(P<0.05);与PFOS组相比,PFOS+Fer-1组的荧光强度显著降低(P<0.05)。暴露于PFOS的HK-2细胞中的绿色荧光比DMSO组和PFOS+Fer-1组显著增强。与DMSO组相比,PFOS组的Bax、Caspase12和Caspase3蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与PFOS组相比,PFOS+Fer-1组的Bax、Caspase12和Caspase3蛋白表达显著降低(P<0.05)。7.抑制内质网应激后内质网应激相关蛋白表达水平与DMSO组比较,PFOS组的GRP78、IRE1和PERK蛋白表达显著升高(P<0.05);与PFOS组相比,PFOS+4-PBA组的GRP78和PERK蛋白表达显著降低(P<0.05)。8.抑制铁死亡后内质网应激相关蛋白表达水平与DMSO组比较,PFOS组的GRP78、IRE1和PERK蛋白表达显著升高(P<0.05);与PFOS组相比,PFOS+Fer-1组的GRP78和PERK蛋白表达显著降低(P<0.05)。9.各组细胞内肾损伤因子的表达水平与DMSO组比较,PFOS组的KIM-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与PFOS组比较,PFOS+Fer-1组的KIM-1蛋白表达水平显著降低(PAZD1152-HQPA<0.05);与PFOS组比较,PFOS+4-PBA组的KIM-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论:1.PFOS可导致HK-2细胞出现氧化应激和脂质过氧化,同时抑制抗氧化系统的激活,造成细胞损伤和凋亡。2.PFOS可致HK-2细胞发生铁死亡,抑制铁死亡可缓解PFOS所致的HK-2细胞损伤。3.PFOS可导致HK-2细胞出现内质网应激,其机制可能是通过IRE1和PERK通路介导的,抑制内质网应激可缓解PFOS所致的HK-2细胞损伤。4.抑制铁死亡可缓解PFOS导致的内质网应激,表明铁死亡可能参与了PFOS介导的内质网应激过程。5.PFOS可导致HK-2细胞出现凋亡。