房颤(Atrial fibrillation,AF)是一种常见的持续性心律失常,全球约有1%的人口受其影响。AF常导致心脏快速而不规则的心律反应,不仅降低患者的生活质量和增加医疗负担,还显著增加并发症的发病率和死亡率。尽管过去几十年的研究揭示了 AF发生和发展的一些机制,例如离子通道重构和纤维化等,但是AF的治疗仍然面临重大挑战。这主要是因为我们对AF心房重构的潜在机制尚不十分清楚。因此,寻找针对心房重构的新治疗策略对于AF的预防和治疗可能提供新的思路和方法。心房的结构重构对于房颤的发生与维持中起着至关重要的作用,尤其是纤维化过程。心房纤维化时细胞外基质蛋白如胶原蛋白和纤连蛋白的过度积聚导致纤维化组织形成,占据了正常心房肌细胞的空间,使心房的收缩与舒张功能减退,干扰心肌细胞之间的电传Medical Abortion导耦联,并形成电传导的解剖屏障。这种纤维化解剖屏障的形成进一步减慢了心电传导与扩布速度,形成无规则的阻滞区域,增加了折返环路和异位电信号活动,从而成为房颤的触发器和维持因素。selleck激酶抑制剂尽管心房结构重构在房颤的发生和发展中扮演着重要角色,但由于心房组织的复杂性,目前对于其结构重构机制的认识仍然有限,这一限制阻碍了人们对房颤机制的深入探索。单细胞测序的发展为我们提供了独特的机遇,使我们能够从单个细胞的分辨率揭示心房组织的复杂性。通过单细胞测序,我们对心房的细胞组成进行深入探索,并确定其中的关键细胞类型。针对关键细胞类型,我们进一步研究了房颤心房结构重构过程中的细胞特征以及细胞之间的相互作用。这些研究发现将使我们对房颤的机制有更加深入的了解,并为房颤治疗提供更多的新思路。本研究主要内容包含如下三个部分:第一部分成人心房单细胞图谱及房颤心房结构重构过程中的关键细胞背景:心房颤动是临床上最常见的持续性心律失常,心房结构重构是促进房颤发生并维持的关键过程,然而该过程的作用机制尚不明确。构建正常至房颤过程中的心房单细胞图谱,寻找关键细胞亚群,对揭示房颤心房结构重构的深层机制具有重要意义。目的:构建成人心房单细胞图谱,揭示房颤心房结构重构过程中的关键细胞。方法和结果:本研究提取公共数据库中所有涉及心房样本的数据集进行单细胞整合分析,揭示了心房主要由8种细胞构成,包括心肌细胞(CMs,31.0%),成纤维细胞(FBs,26.1%),周细胞(PCs,13.0%),内皮细胞(ECs,1 1.3%),髓系免疫细胞(6.2%),平滑肌细胞(4Nirmatrelvir.0%),淋系免疫细胞(3.2%),以及脂肪细胞(2.3%)。ECs在正常及潜在重构心房中起主要调控作用,其中与FBs的相互作用最为显著。为进一步分析ECs在房颤心房中的作用,我们收取3例行外科房颤消融患者的左心耳以及3例窦性心律供心的对应部位进行单细胞测序。拟时序分析结果表明,房颤心房FBs显著激活,发生典型的结构重构即纤维化,该过程受ECs的主要调控,TGFB1为ECs作用于FBs的最重要细胞因子。通过构建FBs示踪鼠Col1a2-Cre;R26RGFP进一步验证了该相互作用的空间可及性。另外,在房颤心房结构重构过程中,ECs显著上调间质标志物,出现间质激活的可塑性。结论:成人心房由众多细胞组成,其中ECs具有重要调控作用,是促进房颤心房结构重构的关键细胞亚群。单细胞测序提示ECs通过TGFB通路激活FBs参与房颤心房结构重构,该过程中ECs表现为显著的间质激活可塑性。第二部分谱系示踪验证房颤心房结构重构过程中内皮细胞具有间质激活的可塑性背景:房颤单细胞图谱揭示了内皮细胞(ECs)具有间质激活的可塑性,是ECs参与心房结构重构的重要机制。然而,关于内皮间质转化是否存在及其对纤维化的贡献意义始终存在争议。为明确房颤发生过程中ECs的间质激活特性以及其对心房结构重构的贡献,需联合房颤动物模型,谱系示踪技术和单细胞测序,揭示ECs在房颤心房结构重构过程中的最终转归。目的:寻找最适房颤结构重构小鼠模型,在体示踪ECs,明确房颤心房结构重构过程中ECs的可塑性及其对纤维化的贡献程度。方法和结果:本研究构建了四种小鼠模型包括血管紧张素Ⅱ诱导的心房纤维化模型(AngⅡ)、主动脉缩窄模型(TAC)、心肌梗死模型(MI)和导丝损伤瓣膜模型(Wire injury)。相应模型分别于术后4周,8周,8周和12周进行心房大小检测,纤维化评估和电生理表型检测。心房大小由超声评估左房前后径,纤维化通过马松染色及免疫荧光判断FBs激活特征,电生理表型通过心内导管检测房颤诱发率及心房有效不应期。结果显示,除外Wire injury模型,AngⅡ,MI和TAC模型心房显著增大,分别为假手术组的1.3,1.2和1.4倍。纤维化显著增加,分别为假手术组的2.1,1.9和7.1倍。四种模型中仅AngⅡ和TAC模型房颤诱发率显著提高,分别为假手术组的2.03和2.09倍。所有模型中仅TAC术后心内膜下出现FBs激活,且TAC模型的纤维化分布与人心房组织最为接近。选用TAC作为后续ECs示踪鼠(Cdh5-Cre;R26RRFP)的房颤建模术式,分选心房干预前后RPF细胞进行单细胞测序。拟时序分析及基因评分揭示了心房重构过程中ECs存在不同的分化轨迹,所有轨迹均呈现出间质激活特征。然而,免疫荧光显示蛋白层面ECs转化为间质细胞数量较少,存在转录与蛋白层面ECs间质化现象的差异。结论:TAC模型具有显著的心房纤维化及较高的房颤诱发率,是研究房颤心房重构尤其是结构重构的最适小鼠模型。在TAC基础上,谱系示踪结合单细胞测序明确了房颤心房结构重构过程中ECs间质激活的可塑性。然而这种可塑性存在转录与蛋白层面的差异,有待后续进一步探索研究。第三部分具有可塑性的内皮细胞通过TGFB1通路调控成纤维细胞功能参与房颤心房结构重构背景:谱系示踪联合单细胞测序明确了房颤心房结构重构过程中ECs间质激活的可塑性。然而这种特征出现了转录与蛋白层面的不一致性。转录层面间质激活是ECs分化轨迹中最显著的特征,而蛋白层面,完全转化为间质细胞的ECs却极为稀少,提示ECs参与心房结构重构的过程并非通过转化为间质细胞来实现。ECs间质激活的意义有待进一步探索。目的:明确ECs间质激活的意义以及ECs参与房颤心房结构重构的主要方式。方法和结果:本研究首先通过免疫荧光及高通量细胞表型检测明确ECs间质激活后较少转化为间质细胞。ECs示踪鼠Cdh5-Cre;R26RRFP行主动脉缩窄术(TAC)后共定位 RFP 与 α-SMA、COL1A1,PDGFRα,DDR2,FAP 和 LTBP2。除外α-SMA,其余间质标志物均无ECs共定位现象。α-SMA与ECs共定位比例亦为稀少,占比仅0.1%。其余模型,包括血管紧张素Ⅱ诱导的心房纤维化模型(AngⅡ)、心肌梗死模型(MI)和导丝损伤瓣膜模型(Wire injury)中均未见RFP与α-SMA、COL1A1,PDGFRα,DDR2,FAP和LTBP2共定位现象。体外采用高通量细胞表型检测实时采集ECs的细胞形态、转化及迁移过程。结果显示ECs间质激活过程中细胞面积、长度和宽度显著增大,圆度和宽长比显著降低。ECs转化为间质细胞的比例约为0.3%。ECs迁移速率显著下降。除外ECs形态变化,其余参数均不符合传统内皮间质转化现象。本研究进一步分选人心房原代ECs及FBs进行细胞互作实验。结果显示间质化ECs通过异常释放TGFB1促进了 FBs的激活,增殖,胶原沉积与释放。TGFB1特异性受体抑制剂SB431542可以抑制该过程。腺相关病毒RGDLRVS-AAV9-Cdh5-Tgfb1在体ECs过表达Tgfb1后小鼠心房显著扩大,纤维化程度显著增加,房颤持续时间延长。结论:房颤心房结构重构过程中,ECs间质激活的意义不在于本身转化为间质细胞构成纤维化的一部分,而在于促进FBs的激活、增殖、胶原沉积与释放等纤维化表型。该过程主要通过TGFB1通路实现。