目的:肠道是药物吸收从而发挥疗效的重要部位,从肠道内源性环境的维度研究药对协同增效机制有助于阐述药对配伍现代科学内涵。诸多报道表明药对之间存在着口服互促吸收的现象,对于该现象的解释主要聚焦在相伍成分可能抑制外排蛋白~([1-2])、影响细胞间紧密连接~([3])等方面。然而,仍有文献研究表明除上述机制外还有药对存在着相互促吸收的效果,如葛根-丹参~([4])、桂枝-茯苓~([5]),说明还有尚未阐明的其他因素。考虑到自组装胆盐囊泡(Bile Salt Vesicles,TL/BSVs)是肠道内源性环境的重要相态,且课题组前期发现囊泡类自聚集体的形成会直接影响被包裹药物的溶解性与渗透性等,推测TL/BSVs的形成与药对互促吸收之间存在必然联系。据此,本项目拟在前期课题组的研究基础上,以葛根-丹参为模型药对,开展体外与在体评价来探讨TL/BSVs对药对互促吸收的贡献,完善药对协同增效的药学证据,丰富相使药对配伍合理性的科学内涵,进一步为中药药对创新制剂的开发提供科学依据。方法:1.肠道内环境中TL/BSVs的存在性验证:通过胆总管引流技术收集雄性SD大鼠胆汁,并以薄膜水化法制备模拟胆汁,采用马尔文激光散射粒度仪、透射电子显微镜等手段对其进行表征,分析对比selleck HPLC两者粒径大小、外貌形态以证实肠道内环境中TL/BSVs的存在。2.TL/BSVs的载药性能研究:以牛磺胆酸钠(Sodium Taurocholate)和蛋黄卵磷脂(Egg Yolk Lecithin)2种材料为载体,以葛根-丹参药对中葛根的主要成分葛根素(Puerarin,PUE)和丹参中主要脂溶性成分(丹参酮ⅡA(Tanshinone IIA,TSA)和隐丹参酮(Cryptotanshinone,CTS))和水溶性成分(丹参素(Danshensu,DSS)和丹酚酸B(Salvianolic acid B,SAB))为模型药物,采用薄膜水化法制备空白胆盐囊泡(TL/BSVs)、4种共载TL/BSVs及5种载单一药物TL/BSVs,采用透射电子显微镜、马尔文激光散射粒度仪对空白及各载药TL/BSVs进行形态表征;通过高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测包封率和载药量来评价共载TL/BSVs体系和载单一成分TL/BSVs体系对药物的增溶效果,并对比分析共载TL/BSVs体系和载单一成Mass media campaigns分TL/BSVs体系的药物析出情况、粒径变化及渗漏率大小来评价不同载药体系的稳定性。3.体内载药TL/BSVs形成的模拟研究:采用全原子分子动力学模拟技术(AA-MD)模拟体内环境下载体与药物的行为轨迹特征,从而判断在体内载体与药物是否会形成载药TL/BSVs;通过方均根偏移(RMSD)来评价体系的稳定情况,计算分析聚集体的回转半径(R_g)反映体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的紧实程度,并通过计算溶剂可及比表面积(SASA)考察体系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的水化程度,三者结合分析探究不同体系的载药稳定性。4.肠道内环境中自组装TL/BSVs对药对吸收效果的研究:采用在体单向肠灌流试验与胆总管结扎技术相结合,首先考察体外制备的不同载药TL/BSVs体系对药对吸收的影响,分析TL/BSVs对药对吸收的影响,排除胆汁中其他因素影响药物的吸收;在此基础上考察不结扎(有胆汁)条件下,肠道内环境中自组装TL/BSVs对药对吸收效果的影响。结果:1.大鼠胆汁及模拟胆汁的表征结果:大鼠胆汁粒径为73.36±0.15nm,模拟胆汁粒径为92.61±0.14nm,透射电子显微镜观察两者形貌均为类球形囊泡状,表明在大鼠胆汁中真实存在自组装纳米相态(TL/BSVs),进一步的研究表明进食脂肪后有利于胆汁分泌,从而增加内源性胆盐分泌量,有利于TL/BSVs形成。2.成功建立了HPLC检测PUE+TSA、PUE+CTS、PUE+DSS及PUE+SAB含量的方法。粒径结果显示空白TL/BSVs为76.14±0.07nm,PDI为0.24,并且各载药体系的PDI均小于0.3,分布均匀;透射电子显微镜结果显示共载TL/BSVs体系的球体颜色较单一载药TL/BSVs体系深,说明共载体系更加紧实,侧面反应共载TL/BSVs体selleck激酶抑制剂系更加稳定;与TSA-TL/BSVs(CTS-TL/BSVs)的包封率和载药量相比,PT-TL/BSVs(PC-TL/BSVs)均有显著性提高;在不同载药TL/BSVs中,药物析出情况变化、粒径变化情况及药物的渗漏率结果均表明共载TL/BSVs体系的稳定性高于载单一药物TL/BSVs。3.全原子分子动力学模拟技术(AA-MD)研究结果表明,牛磺胆酸钠与蛋黄卵磷脂载体材料与“葛根-丹参”有效成分会自聚集,形成稳定的聚集体即载药TL/BSVs,而胆固醇不影响载体与药物的聚集行为,且共载TL/BSVs体系在70 ns时,体系就会趋于稳定。计算结果显示体系Ⅰ(共载体系)的SASA及R_g均小于体系Ⅱ和体系Ⅲ(载单一药物体系),进一步验证了共载TL/BSVs体系的稳定性会优于载单一葛根素体系及载单一丹参有效成分体系。4.肠吸收结果表明,在无胆汁模型中,与PUE、DSS及SAB混悬液的P_(app)和K_a相比,通过体外制备的载药TL/BSVs有显著性提高,说明TL/BSVs可以促进药对的吸收;有胆汁模型中PUE、DSS及SAB混悬液的P_(app)和K_a结果也高于无胆汁模型,说明肠道内源性中TL/BSVs对于PUE、DSS及SAB的肠吸收也有显著提高。结论:胆汁中胆盐等内源性成分经外源性物质刺激后在肠道发生自组装并形成纳米囊泡,药对中脂溶性成分参与其中并被包裹,成分的溶解性及渗透性均得到改善。