乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenases,ADH)是氧化还原酶家族的成员,能够利用辅因子可逆地催化醇的氧化和醛的还原。乙醇脱氢酶具有广泛的底物特异性和较高的对映选择性,其催化底物包含正链和支链脂肪醇、芳香醇、伯醇和仲醇以及相应的醛和酮等。因此它在研究生物体内乙醇代谢、疾病诊断、医学分析、有机合成和生物制药等领域有着极大的研究价值。然而,常温的乙醇脱氢酶往往受限于生产工艺的高温要求,导致其无法应用于大规模的生产工艺。极端嗜热微生物编码的乙醇脱氢酶具有嗜热性和热稳定性,正好能够满足高温生产工艺的要求。极端嗜热嗜压古菌Thermococcus barophilus CNirogacestat molecular weighth5分离于大西洋中脊的一个热液口,能够耐受95℃的高温环境和40 MPa的高压环境。目前T.barophilus Ch5的基因组测序已经完成,编码2个NAD+依赖性的长链乙醇脱氢酶:Tba-ADH641和Tba-ADH547。本论文研究了 Tba-ADH641催化乙醇氧化和乙醛还原的最适反应温度、pH值、金属离子偏好性、底物专一性和热稳定性等生化性质,并通过构建突变体研究了保守结构域的部分氨基酸残基对Tba-ADH641酶活性的影响,具体的结论如下:本论文的第一部分研究内容是关于Tba-ADH641的基因克隆和蛋白的表达纯化。我们首先利用PCR技术扩增Tba-ADH641基因片段,再通过酶切、连接等分子克隆技术构建Tba-ADH641-pET30a(+)表达载体,通过酚氯仿抽提方法和测序验证阳性克隆。确认阳性克隆后,将验证后的Tba-ADH641-pET30a(+)质粒转化至表达细胞E.coli BL21 DE3进行诱导表达。将离心收集的诱导细胞进行超声波破碎,然后热处理去除部分杂蛋白,最后通过Ni柱亲和纯化得到Tba-ADH641蛋白(45 kDa)。另外,对纯化的Tba-ADH641蛋白进行凝胶过滤实验,结果发现,在pH 8.0的条件下该酶是单体蛋白。本论文的第二部分研究内容是关于Tba-ADH641催化乙醇氧化和乙醛还原的生化性质研究。生化数据表明,Tba-ADH641催化乙醇氧化的最适温度为65℃,而催化乙醛还原的最适温度为80℃,但其氧化活性和还原活性最适反应pH值均为8.0。热稳定性实验结果表明,在70℃加热20min后,Tba-ADH641丧失了约50%的活性,且在90℃热处理20 min后,该酶丧失了 94%氧化活性,而该酶在100℃加热20 min后,该酶仍保持21%的还原活性,因此该酶的氧化活性的热稳定性要低于其还原活性的热稳定性。Tba-ADH641的氧化活性不依赖金属离子,其中Cu2+、Mn2+、Mg2+对该酶的氧化活性表现出不同程度上的抑制作用,而Zn2+和Fe2+对该酶的氧化活性具有促进作用,其中Fe2+的促进效果最好。但是,Tba-ADH641的还原活性依赖二价金属离子,其中Ca2+、Fe2+和Mg2+对该酶的还原活性表现出促进作用,其中Mg2+是最佳的金属离子,而Cu2+、Ni2+、Zn2+和Mn2+均可抑制该酶的还原活性。底物专一性实验结果显示,Tba-ADH641催化醇氧化的效率从高到低的顺序依次为乙醇>1-丁醇>1-己醇;该酶催化醛还原的效率从高到低的顺序依次为乙醛>丙酮≈1-丁醛>己醛。动力学实验结果表明,Tba-ADH641催化乙醛还原的效率高大于催化乙醇氧化的效率。本论文的第三部分的研究内容是关于Tba-ADH641催化机理的研究。研究发现,Tba-ADH641更偏向于使用NADP(H)作为催化反应的辅因子而不是NAD(H)。突变数据显示,Tba-ADH641 D115A突变体完全失去了氧化和还原的活性,表明氨基酸残基D1LY-188011细胞培养15是该酶催化乙醇氧化和乙醛还原所必需的关键位点之一。进一步的研究发现,Tba-ADH641 K118A、E159A、D190A和E215A突变体保留了部分氧化和还原活性,因此氨基酸残基K118、E159、D190和E215参与了该酶的氧化和还原反应。有趣的是,Tba-ADH641 E159A突变体在存在NADP(H)时比存在NAD(H)时其催化乙醇氧化和乙醛还原的相对活性分别提高43.5倍和15.2倍,表明氨基酸残基E159可能与辅因子结合有关,并参与部分催化。综上,本论文通过分子生物学技术和生物化学技术揭示了 Tba-ADH641的生化性质,并探讨了该酶的催化机理,为揭示极端嗜热古菌的催化醇的氧化和醛的还原的机理提供理论依据。另外,Tba-ADH641能够在高温条件下催化乙醇氧化和乙醛还原,并具有耐高Biogeophysical parameters温的特性,从而为生物转化反应提供耐高温的乙醇脱氢酶。因此,本论文的研究成果具有潜在的应用价值。