L-色氨酸是人体必需的8种氨基酸之一,被广泛应用于食品、医药和饲料等领域。与传统的工业生产方法相比,目前,微生物发酵法生产L-色氨酸已逐渐占据市场主流。然而,在复杂的生物合成路径中存在反馈调节机制,导致L-色氨酸的糖酸转化率难以提高。因此,本研究开发了一株解除反馈调控、适宜L-色氨酸生产的大肠杆菌(Escherichia coli)作为底盘菌株,通过模块化工程、代谢产物谱分析、启动子工程等策略,显著提高了L-色氨酸的产量与转化率。主要研究结果如下:(1)构建合成L-色氨酸底盘微生物:首先,敲除阻遏蛋白编码基因trp R与弱化子trp L,在转录水平解除L-色氨酸引起的阻遏与弱化作用。其次,引入合成路径中关键基因的抗反馈突变体Aro G~(S211F),解除代谢路径中的限速瓶颈。最后,将所得底盘菌株E.coli TRP3进行发酵罐水平验证,分析发酵结果并确定主要副产物及含量。经40 h发酵,L-色氨酸产量达到11.80 g·L~(-1),糖酸转化率为8.25%。同时,发酵液中副产物主要包括乙酸和乳酸,其含量分别达到9.63 g·L~(-1selleck HPLC)和12.41 g·L~(-1)。(2)重构中心代谢路径增加前体DAHP供应:首先,根据副产物分析结果,通过文献挖掘得到乙酸和乳酸合成的相关基因pox B、tdc D、pta、ack A、ldh A和dld,摇瓶评价筛选出合适的敲除靶点pox B和ldh A。其次,在上述靶点的基因座中分别插入前体合成的关键基因pps A和tkt A,提高PEP和E4P的供给。最后,过表达合成路径中关键基因aro G~(fbr),使碳代谢流富集至L-色氨酸合成路径。经5-L发酵罐验证,重组菌株E.coli TRP6的产量较E.coli TRP3提高47.71%,达到17.43 g·L~(-1);糖酸转化率提高35.76%,达到11.20%。与此同时,对发酵液中副产物进行检测,乙酸和乳酸含量分别降低了63.97%和56.41%。对下一模块中的代谢中间产物检测发现,3-脱氢莽草酸和莽草酸显著积累,分别达到4.52 g·L~(-1)和2.50 g·L~(-1);而代谢节点分支酸含量较低,仅0.64 g·L~(-1)。(3)优化莽草酸途径增加分支酸供应:首先,文献挖掘莽草酸路径至分支酸节点的关键代谢靶点aro B、aro E和aro L。其次,通过启动子工程优化各靶点基因的表达强度,以优化莽草酸途径代谢效率。最后,将最优结果组合整合至基因组,强化莽草酸路径的代谢流并降低菌株负担。在5-L发酵罐中验证重组菌株E.coli TRP7的生产水平,L-色氨酸的产量和糖酸转INCB28060浓度化率分别达到23.41 g·L~(-1)和34.31%。3-脱氢莽草酸与莽草酸的含量分别降低至1.51 g·L~(-1)和0.86 g·L~(-1);分支酸含量从0.64 g·L~(-1)增加到3.64 g·L~(-1)。(4)理性改造L-色氨酸终端合成途径促进L-色氨酸合成:首先,过表达L-色氨酸操纵子,强化L-色氨酸终端合成途径的代谢通量。其次,启动子工程优化终端合成途径中前体物质的合成基因serA和prs,强化L-丝氨酸与磷酸核糖焦磷酸PRPP供给,将最优结果组合整合至基因组。最后Non-HIV-immunocompromised patients,在5-L发酵罐水平验证菌株E.coli TRP9的生产性能,L-色氨酸含量达到36.08 g·L~(-1),糖酸转化率为18.55%,达到理论转化率的81.72%。