聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHAs)是一种由亲盐古菌和多种细菌合成,可以从植物生物量、油、糖甚至二氧化碳等可再生资源中生产的生物基塑料,具有生物相容性和可生物降解性。一些细菌如Pseudomonas savastanoi和Pseudomonas putida在含有正苯链烷酸作为碳源的培养基中可以合成芳香族聚酯作为石油衍生的芳香族聚合物如聚氯乙烯(Polyvinylchloride,PVC)和聚苯乙烯(Polystyrene,PS)的替代品应用前景广泛。因此通过基因工程手段构建具有合成与石油基PET或PS性质类似的含苯环PHA基因工程菌研究引人瞩目。本研究选择来源于Clostridium diffcile的具有催化苯环脂肪酸底物形成聚合前体的2-羟基异己酸Co A-转移酶Had A_(Cd)作为前体供给酶,选择来源于Pseudomonas aeruginosa 93-3-1的PHA合酶Pha C1_(Pa93)及其突变体Pha C1_(Pa93(STQK))用于PHA聚合。根据两类酶的底物特异性分析,基于设计的PHA合成途径,构建以大肠杆菌为宿主含有重组质粒p QE-80L-had A_(Cd)-pha C1_(Pa93)/pha C1_(Pa93(STQK))或p ACYCDute1-pha C1_(Pa93)/pha C1_(Pa93(STQK))-had A_(Cd)的工程菌株,利用葡萄糖和含苯环的脂肪酸作为碳源培养基因工程菌,探讨其合成PHA的能力和结构。首先,利用体外重组技术过表达并提纯了HadA_(Cd)和PhaC1_(Pa93)及其突变体Pha C1_(Pa93(STQK))并分析了其活性和底物特异性。将扩增的基因片段分别与载体连接构建重组质粒转导入宿主获得三个重组菌BL21-p ColdⅡ-had A_(Cd)、BL21-p QE-80L-pha C1_(Pa93)和BL21-p QE-80L-pha C1_(Pa93(STQK))。体外大量培养重组菌表达目的蛋白并利用6His标签并纯化,获得蛋白浓度分别为Had A_(Cd)(15.8 mg/m L)、Pha C1_(Pa93)(3.8mg/m L)和Pha C1_(Pa93(STQK))(5.4 mg/m L)。三个蛋白的底物特异性分析结果表明,Had A_(Cd)对(R)-3HB、4HBZ、HPBA和(R)-MA酶活性为0.1264±0.0011 U/mg、0.1193±0.0019 U/mg、0.1595±0.0003 U/mg和0.1287±0.0023 U/mg;Pha C1_(Pa93)仅对(R)-3HBCoA有活性,其酶比活力为0.1400±0.0002 U/mg;PhaC1_(Pa93(STQK))对(R)-3HBCo A、4HBZCo A、HPBACo A和(R)-MACo A酶活性为0.1371±0.0009 U/mg、0.1266±0.0012U/mg、0.0980±0.0011 U/mg和0.1548±0.0019 U/mg。其次,分别使用pQE-80L和pACYCDute-1两种质粒,构建含HadA_(Cd)和Pha C1_(Pa93)/Pha C1_(Pa93(STQK))的共表达载体,并在蛋白表达水平检测其表达情况。通过分子生物学手段,构建含had A_(Cd)和pha C1_(Pa93)/pha C1_(Pa93(STQK))的重组质粒p QEHC、p QEHSTQK、Dinaciclib溶解度p ACH和p ASTQKH,基因工程菌培养后菌液蛋白质表达检测结果表明,基于p ACYCDute-1构建的共表达载体p AC/STQKH在氮限制的条件下,Had A_(Cd)和Pha C1_(Pa93)/Pha C1_(Pa93(STQK))蛋白能自主、稳定的同时表达。将其分别转导DH5α和XL-Blue得到稳定表达两种目的蛋白的基因工程菌DHp QEHC、DHp QEHSTQK、DHp ASTQKH和XLp ASTQKH。最后,对基因工程菌DHpACH和DHpASTQKH培养,利用~1H-NMR分析合成产物的结构;并对DHp ASTQKH进行培养条件优化。DHp ACH在仅添加2%葡萄糖和额外添加Rodent bioassays(R)-3HB的条件下,合成产物的~1H-NMR结果显示,均在5.3 ppm、2.6ppm和1.3 ppm处有特征峰,推测为PHB;DHp ASTQKH在仅添加2%葡萄糖、额外添加(R)-3HB和(R)-MA时,合成产物的~1H-NMR结果显示,仅在5.3 ppm、2.6 ppm和1.3 ppm处有特征峰,推测为PHB,而额外添加4HBZ或HPBA时,合成产物的~1H-NMR结果显示,均在0.75 ppm、1.36 ppm、1.65 ppm、2.6 ppm、5.2 ppm和5.3ppm更多都有特征峰,推测产物为PHBV。对DHp ASTQKH进行培养条件优化,以4m M HPBA或6 m M 4 HBZ为底物,在p H=8,额外添加4 g/L乙酸钠溶液,于LB培养基中,使用XLpASTQKH菌株培养可获得最大的CDW和PHA产量。