硫化物醌氧化还原酶(sulfide quinone oxidoreductase,SQR)是一种古老的核黄素蛋白,属于二硫化物氧化还原酶家族(Disulfide oxidoreductase family,DSR),主要功能是将硫化物氧化为单质硫,并将电子传递给醌完成呼吸链。嗜酸喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)是生物浸出过程中的优势微生物,其最主要的能量来源是硫代谢,而SQR是硫氧化反应途径中的首个关键酶,在硫代谢中发挥着重要的作用。本研究以A.caldus来源的SQR~(Ac)为对象,利用分子生物学和生物信息学技术对SQR~(Ac)的性质、功能以及催化机理进行了一系列研究。(1)通过对SQR同源序列的进化树构建和亚细胞定位研究,鉴定了SQR~(Ac)属于六大类蛋白中的一类SQR蛋白,具备三个保守半胱氨酸位点(Cys128、Cys160、Cys356);确定了SQR蛋白属于内在膜蛋白,蛋白内部不存在信号肽和跨膜结构。(2)通过同源重组构建了大肠杆菌(Escherichia coli)的SQR蛋白表达菌株BL21-p ET28a:sqr,实现了SQR~(Ac)在E.coli BL21(DE3)中的胞内可溶性表达。重组SQR~(Ac)的分子量约为47.7 k Da。测定了SQR~(Ac)的酶促反应动力学参数:K_(m(sulfide))为23.5μM,V_(max(sulfide))为0.51±0.05μmol·min~(-1)·mg~(-1),K_(m(DUQ))为17.4μM,V_(max(DUQ))为0.60±0.05SB431542研究购买μmol·min~(-1)·mg~(-1)。通过测定SQR~(Ac)蛋白在375 nm和450 nm处特征吸收峰的变化,测定了1 mol的SQR~(Ac)蛋白中含有约1 mol的黄素腺嘌呤二核苷酸。(3)通过Alpha Fold蛋白结构预测获得了SQR~(Ac)的三维结构模型,发现SQR~(Ac)的蛋白结构符合二硫键氧化还原酶家族蛋白的特征,由两个串联的罗斯曼结构域(Rossmann fold domain)和一个非常灵活易曲的C-端结构域组成。单个罗斯曼折叠结构域包括6个平行的β折叠与sandwich bioassay两对α螺旋形成的β-α-β-α的拓扑结构。对比SQR~(Ac)的结构与嗜酸氧化亚铁硫杆菌的SQR~(Af)结构发现,两种蛋白的C端构象有着明显不同,可能是因为SQR~(Af)的C端α螺旋异常灵活导致两者的构象产生明显差异。(4)通过模拟丙氨酸突变扫描和同源序列的比对分析筛选到了五个关键氨基酸位点(Cys128、Cys160、Cys356、His132、His198),将五个位点突变为丙氨酸后,Fer-1 NMR构建了大肠杆菌的表达菌株。分离纯化获得了五种突变体蛋白,并对五种蛋白分别进行体外硫化物醌氧化还原反应实验,发现Cys128,Cys160和Cys356的突变会导致蛋白的酶活性显著降低,而His132和His198的突变对SQR~(Ac)酶活性无明显影响。结合SQR~(Ac)的三维结构特征以及突变体蛋白的体外硫化物醌氧化还原反应实验,提出了一种适用于A.caldus的硫化物醌氧化还原机制模型。