细胞周期(Cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程,分为间期与分裂期两个阶段。在整个细胞周期循环中,蛋白质翻译后修饰(Post-translational modifications,PTMs)中常见的两种类型蛋白质磷酸化及乙酰化,贯穿于整个细胞周期中。已知所有真核细胞有丝分裂期的MDV3100启动是由Cyclin/CDK1复合物调控,可催化多种蛋白发生磷酸化,从而引起这些蛋白的结构和功能状态的改变,进而导致细胞内代谢活动的变化。实际上,单独Cyclin Dependent Kinase 1(CDK1)存在时无激酶活性,当与细胞周期蛋白Cyclin A/B结合形成复合体后,由Wee1/Myt1激酶和CDK7激酶催化CDK1上的Thr14、Tyr15、Thr161位点磷酸化,随后在磷酸化酶CDC25的催化下,使T14/Y15位点发生去磷酸化,从而表现出活性。CDK1的翻译后修饰除了磷酸化之外,还有泛素化和乙酰化。但是,目前为止CDK1的乙酰化修饰,尤其是有关CDK1特定位点的乙酰化修饰对细胞功能影响的研究少有报道。在本论文中,利用一系列生化和分子生物学实验,我们探究了CDK1的翻译后修饰对其生物学功能的影响。实验结果总结如下:首先,利用构建成功的pc DNA3.1/Flag-CDK1或pc DNA3.1/Myc-CDK1质粒,在不同细胞株(HEK293T,Hep G2,MCF-7)中过表达后进行标签免疫沉Tezacaftor浓度淀,再结合泛乙酰化(Pan-ac)抗体明确了CDK1的乙酰化修饰;另外,利用广谱HDAC(Histone Deacetylase)抑制剂TSA(Trichostatin A)或SIRT(Sirtuin)家族抑制剂NAM(Nicotinamide)处理细胞后再观察CDK1的乙酰化修饰变化,发现TSA的去乙酰化作用明显。我们进一步用MS-275(常作为HDAC1的特异抑制剂使用)处理细胞后免疫沉淀CDchemically programmable immunityK1,发现CDK1的乙酰化水平增高,提示HDAC1可以去除CDK1上的乙酰化修饰;我们进一步利用共转染/免疫共沉淀技术,验证HDAC1与CDK1的相互结合,同时明确HDAC1对CDK1的去乙酰化作用;另外,利用细胞免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜明确HDAC1和CDK1蛋白在细胞核内的共定位。其次,根据课题组利用组蛋白乙酰基转移酶MOF(Human males absent on the first)复合物中MSL1(Human male-specific lethal 1)亚基敲除细胞进行的乙酰化/磷酸化差异表达质谱分析数据,CDK1在赖氨酸K33位点可能有乙酰化修饰,构建了CDK1K33R点突变质粒,并通过共转染/免疫共沉淀实验明确CDK1K33位点乙酰化水平可以被MOF/HDAC1所调控。有趣的是,用HDAC1去除CDK1K33位点乙酰化修饰则导致CDKY15位点磷酸化水平的降低,提示CDK1的乙酰化/磷酸化之间的相关性。再次,利用药物同步化来控制细胞周期,观察在不同细胞周期CDK1乙酰化修饰程度的变化。结果显示,CDK1乙酰化在G1/S期相对高于其他时期,而且CDKY15磷酸化的变化趋势与CDK1的乙酰化相同,提示CDK1的乙酰化/磷酸化修饰可能协同调控细胞周期进程。最后,从网络数据库的生物信息分析发现HDAC1和CDK1在肝癌中差异表达显著。我们选用Hep G2肝癌细胞进行了细胞增殖和集落形成实验。结果表明,过表达CDK1可以抑制Hep G2细胞增殖和集落形成能力,而过表达CDK1K33R突变体则失去对Hep G2细胞增殖和集落形成能力的抑制作用。另外,在SHSY5Y细胞中,转染CDK1K33R乙酰化位点突变体质粒,可以促进细胞迁移,而加入HDAC1抑制剂MS-275则使SH-SY5Y细胞的迁移受到抑制。综上,本研究明确了CDK1与HDAC1之间的互作关系;MOF/HDAC1调控CDK1K33位点乙酰化修饰水平;CDK1K33位点乙酰化和CDK1Y15位点磷酸化协同参与调控细胞周期进程;CDK1K33位点乙酰化抑制Hep G2细胞增殖和集落形成能力以及SH-SY5Y细胞迁移。我们的实验结果将为肿瘤靶向治疗药物的设计及临床分子诊治策略提供理论与实验基础。